Оценка функциональной активности клеток

Лекция 8 от 11 октября

ЦИТОДИАГНОСТИКА. ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ КЛЕТКИ. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫРЕАКЦИИ КЛЕТОК НА ДЕЙСТВИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ.

Прогресс в развитии современной медицины связан с внедрением новых технологий клеточной и генной терапии. В их основе лежат выяснение молекулярных механизмов регуляции жизненного цикла клеток, разработка способов визуализации клеток, находящихся в разном функциональном состоянии. Благодаря этому стала возможной идентификация клеток отдельных линий (эндотелиоцитов, нейронов, глиоцитов, миофибробластов, лимфоцитов разных типов), позволяющая оценить структурные основы развития физиологических (рост, органогенез, адаптация и пр.) и патологических (неоплазии, гипотрофии и пр.) процессов. Прицельная оценка разных морфогенетических процессов (пролиферации, дифференцировки, функциональной активности, старения и гибели клеток) базируется на комплексном анализе структурных элементов клетки.

Форма, размеры, расположение клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматическое отношение, тинкториальные свойства ядер и цитоплазмы характеризуются тканевой и органной спецификой. Эти критерии лежат в основе общеморфологической диагностики тканей и органов.

Перед изучением методов и возможностей цитодиагностики, попробуем интегрировать раннее изученный материал и объединить структуры в определенные функциональные аппараты. К ним относятся:

1) аппарат хранения и реализации генетической информации – ядро;

2) метаболический аппарат клетки, обеспечивающий анаболические и катаболические процессы;

● аппарат синтеза и секреции (рибосомы – синтез белков гиалоплазмы и ядра; гранулярная эндоплазматическая сеть – синтез мембранных и секретируемых белков; комплекс Гольджи – сортировка, накопление, выведение секрета);

● аппарат катаболизма и энергообеспечения (лизосомы – деградация полимеров до мономеров; митохондрии – расщепление мономеров с освобождением энергии, которая заключается в макроэргические связи АТФ; в гиалоплазме – ферменты гликолиза обеспечивают анаэробный метаболизм).

3) аппарат поддержания и изменения формы, миграции клетки – включает комплекс плазмолеммы, цитоскелета и кариоскелета;

4) аппарат внутриклеточного транспорта – связан с транспортными процессами через плазмолемму (например, эндоцитоз). Помимо плазмолеммы. Включает комплекс Гольджи, систему эндосом, микротрубочки, цистерны гладкой эндоплазматической сети;

5) система цитопротекции – периксосомы, гладкая эндоплазматическая сеть, белки теплового шока (БТШ) ядра и гиалоплазмы, протеасомы;

6) митотический аппарат клетки – центриоли и система микротрубочек.

Работа всех этих функциональных аппаратов определяется активностью сигнальных молекул, регулируемых через разные рецепторы. Благодаря этому жизнедеятельность каждой клетки находится под контролем регуляторных систем организма (медиаторы, гормоны), локальных факторов и соседних клеток.

Ключевым параметром цитодиагностики является определение отношения клетки к тому или иному периоду жизненного цикла. Клетки в разные периоды жизненного цикла имеют разное строение и свойства, в них происходят разные процессы.

Жизненный цикл клетки – существование клетки от образования до гибели.

Его длительность варьирует от нескольких суток (в эпителии желудка и кишечника) до десятилетий (в сердечной мышце, нервной ткани). Жизненный цикл клетки включает первый период (когда клетка недифференцирована и делится), второй период (дифференцирования), третий период (зрелости и функциональной активности, длительность которого варьирует среди разных типов клеток). В четвертый период клетка стареет и гибнет (апоптоз). В физиологических условиях поддерживается баланс между процессами новообразования и гибели клеток.

Практически се ткани и органы человека содержат недифференцированные клетки. Их ключевым свойством является сохранение способности к делению и миграции. морфологическая идентификация этих клеток на уровне световой и электронной микроскопии строится на оценке ядерно-цитоплазматического отношения. Все незрелые клетки имеют высокое ядерно-цитоплазматическое отношение (больше 1). В свою очередь, размер и структура ядра зависят от периода клеточного цикла.

Так, истинные стволовые клетки (в G₀-периоде) имеют темное мелкое ядро. В интерфазных клетках, вовлеченных в цикл, ядро светлое крупное (РИС), с превалированием эухроматина, имеются несколько крупных ядрышек, извилистая ядерная оболочка. В цитоплазме недифференцированных клеток мало мембранных органелл. Основным источником энергии является анаэробное окисление. Наиболее развитые структуры цитоплазмы – это цитоскелет и митотический аппарат. Анаболитические процессы обеспечиваются благодаря наличию многочисленных свободных рибосом и полисом.

Скорость пролиферации клеток и длительность клеточного цикла широко варьируют, что имеет существенное значение для прогнозирования роста органов в эмбриогенезе, репарации тканей после повреждения и развития опухолей (неопластического процесса). Обычные методы микроскопии не могут дать точной характеристики этих процессов, поскольку большинство делящихся клеток находится в интерфазе. В связи с этим особое значение приобретает иммуноцитохимическая оценка процесса пролиферации (деления клеток). Наиболее популярным маркером пролиферации считается Ki-67, экспрессируемый практически в течение всей интерфазы. Можно также оценить наличие и количество клеток, находящихся в разных периодах интерфазы (G₁ S G₂), по метке к специфическим регуляторам этих периодов – циклинам и циклинзависимым киназам.

Дифференцировка клетки проявляется усложнением ее структуры, направленным на выполнение специфической функции. При этом происходит снижение ядерно-цитоплазматического отношения, что связано с увеличением объема цитоплазмы и её функциональных аппаратов, изменением набора органелл и/или включений в цитоплазме, специализацией плазмолеммы, формированием специализированных структур (микроворсинок, ресничек), межклеточных контактов, активацией транспорта и пр. терминальная дифференцировка клеток в некоторых тканях сопровождается потерей ядра и некоторых свойств (например, способности к регенерации, ограничение адаптации). Такой феномен характерен для многослойного плоского ороговевающего эпителия и проявляется формированием высокоспециализированных безъядерных структур – роговых чешуек. Не мене яркий пример – это формирование эритроцитов: процесс дифференцировка в эритроидном ряду направлен на специализацию цитоскелета, синтез и накопление включений гемоглобина, с последующим удалением ядра и органелл.

В основе дифференцировки клетки лежит блокирование в геноме протоонкогенов и активация тканеспецифической программы развития. Например, в эпителиальных тканях дифференцировка сопровождается активацией синтеза белков промежуточных филаментов – цитокератинов. Причем каждая стадия этого процесса сопровождается синтезом специфических цитокератинов. Этот факт лежит в основе определения тканевой принадлежности опухолевых клеток, а также в оценке степени их незрелости.

Однако дифференцировка клеток не всегда сопровождается изменением структуры цитоплазмы. Например, лимфоциты на разных этапах имеют сходную структуру, хотя отличаются по функции. Смысл дифференцировки заключается в приобретении специализированных рецепторов и мембранных белков, получивших название кластеров дифференцировки (CD). В этом случае оценка зрелости и функционального типа клеток базируется на использовании иммуноцитохимических методов, позволяющих выявить типичные маркеры: CD3 - маркер зрелых Т-лимфоцитов, CD4 – Т- хелперы, CD20 и CD22 – В – лимфоциты, CD57 – натуральные киллеры. CD используются также для визуализации клеток, способных распознавать и презентировать антигены (чужеродные для организма белки) – CD1а.

Структура клетки зависит от экспрессии определенного набора генов, химического состава её компонентов и действия регуляторов. В свою очередь, именно структура клетки (характеристики ядра, набор органелл, специфика строения плазмолеммы) детерминирует выполнение специализированной функции, что позволяет проводить структурно-функциональные параллели.

В зависимости от структурно-функциональной организации в организме человека выделяют более 200 видов клеток. Для обобщения материала и понимания закономерностей можно условно разделить клетки на несколько функциональных типов:

1. Клетки, синтезирующие белки (синтетический тип) – фибробласты; эпителиоциты некоторых желёз; нейроны; плазмоциты, секретирующие антитела.

При световой микроскопии активность этих клеток оценивают по следующим критериям: размер ядра, состояние хроматина, количество ядрышек; насыщенность цитоплазмы РНК – базофилия цитоплазмы при окрашивании гематоксилином и эозином, положительная реакция на пиронин (метод Браше); для нейронов используется метод Ниссля.

Типичными ультрамикроскопическими признаками клеток, активно синтезирующих белки, является крупное ядро с превалированием эухроматина (где происходит транскрипция с образованием мРНК), наличие ядрышек (образующих субъединицы рибосом) вблизи кариолеммы, богатой ядерными порами (для эффективного транспорта между ядром и цитоплазмой). Типичный набор органелл и цитоплазме включает развитую гранулярную эндоплазматическую сеть и комплекс Гольджи. Плазмолемма неровная с инвагинациями и признаками везикуляции. Может иметь зоны адгезивных и специализированных контактов.

В некоторых случаях для визуализации белок-синтезирующих клеток используют иммуноцитохимическое исследование, направленное на выявление специфического секреторного продукта – например, гормона, или муцинов.

2. Клетки, участвующие в метаболизме липидов (гепатоциты, адипоциты) и/или продуцирующие стероидные гормоны (эпителий коркового вещества надпочечников, клетки гранулезы фолликулов и желтого тела яичника, гландулоцит яичка (клетки Лейдига)).

Типичными особенностями этих клеток является активное ядро (синтез ферментов) с ядрышками. В цитоплазме развиты органеллы, принимающие участие в метаболизме липидов и углеводов – гладкая эндоплазматическая сеть, комплекс Гольджи, митохондрии (с тубуло-везикулярными кристами при синтезе стероидов); включения липидов и/или гликогена. Поверхность таких клеток, как правило, имеет микроворсинки, повышающие обменную площадь плазмолеммы.

3. Клетки, выполняющие функцию детоксикации и цитопротекции (гепатоциты, клетки Клара, пигментные клетки).

Имеют развитую гладкую эндоплазматическую сеть, в составе которой – ферменты антиоксидатной системы, периксосомы, протесомы, цитоплазма, богатая белками теплового шока. В пигментных клетках (меланоциты, пигментный эпителий глаза) могут присутствовать специализированные структуры – меланосомы, защищающие клетки от ультрафиолетового излучения.

4. Фагоцитирующие клетки (нейтрофилы, клетки системы фагоцитирующих мононуклеаров).

Способны к распознаванию и захвату веществ, частиц, микроорганизмов. плазмолемма таких клеток неровная с инвагинациями и выростами. Цитоплазма богата лизосомами, образующимися за счет комплекса Гольджи, развита система эндосом. Для выяснения таких клеток и оценки их активности используют цитохимические, иммуноцитохимические методы и электронную микроскопию.

5. Транспортирующие клетки (эпителий кишки, почки, цилиарный эпителий глаза, эпендимоциты, клетки исчерченных протоков слюнных желез, эпителий слизистой оболочки желчного пузыря, эндотелий сосудов).

Типичной особенностью является полярность – базальный полюс содержит ядро, фиксирован к базальной мембране, плазмолемма формирует инвагинации и складки, между которыми расположены митохондрии. Апикальный полюс клетки имеет многочисленные микроворсинки и пиноцитозные пузырьки. Селективность транспорта достигается закрытием межклеточных пространств с помощью плотных контактов (обеспечивающих химическую изоляцию) и адгезивных поясков и десмозом (обеспечивающих механическую связь между клетками).

6. Клетки с высокой механической резистентностью (эпителиоциты многослойных эпителиев).

Выполнение такой функции возможно за счет специализации плазмолеммы, мощного цитоскелета и развитых межклеточных контактов. Для плазмолеммы характерно наличие особых белков подмембранного слоя, обеспечивающих увеличение её толщины в 3-5 раз (инволюкрин, кертолинин и пр.). В структуре цитоскелета доминирующие элементы – это промежуточные филаменты, которые могут объединяться и формировать фибриллы, связанные между собой белком филлагрином. Между клетками развиты контакты, обеспечивающие механическую связь – десмосомы, адгезивные соединения, информационный обмен – щелевые контакты. Мощный цитоскелет присутствует также в нейронах, имеющих отростки.

7. Клетки, способные к сокращению (гладкие миоциты, кардиомиоциты, скелетная мышечная ткань, миоэпителиоциты, миофибробласты).

В цитоплазме таких структур развит сократительный аппарат – миофиламенты, которые могут формировать миофибриллы. Их наличие в цитоплазме определяет феномен поперечной исчерченности. Поскольку сокращение – это энергозависимый процесс, элементы цитоскелета всегда связаны с митохондриями, а также с цистернами гладкой эндоплазматической сети, которые депонируют Са²⁺⁺. Иммуноцитохимические выявление сократимых клеток основано на определении белков миофиламентов — актина, тропонина, тропомио- зина, миозина. Кроме того, ряд нарушений процес­са сокращения связан с изменением опорных структур и белков плазмолеммы, что определяет интерес к выявлению десмина, дистрофина и пр.

Это далеко не полный перечень функциональных типов клеток, ряд клеток совмещает в себе структуры и функции нескольких типов. При­мером могут быть сенсорные клетки органов чувств, механорецепторные клетки и пр.

ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК

Зрелые клетки могут находиться в разном функциональном состоя­нии, что определяется их регуляцией гормонами, нейромедиаторами, цитокинами, локальными факторами, компонентами межклеточного вещества, связями с соседними клетками.

Ответ клетки на сигналы реализуется с участием всех ее основных структур: 1) плазмолеммы (за счет рецепторов, каналов и ферментов, формирующих вторичные посредники); 2) цитоплазмы (сигнальные системы гиалоплазмы, рецепторы и каналы в мембранных органеллах, трансдукторы, ферменты метаболизма в гиалоплазме и органеллах); 3) ядра (транскрипционные факторы, гены).

Ответ клетки на стимулы может быть реали­зован сразу (изменением транспорта, сокращени­ем) или проявляться и сохраняться в течение некоторого времени (при активации синтеза белков, индукции дру­гой морфогенетической программы). Чаще акти­вация клетки сопровож­дается увеличением площади плазмолеммы (за счет выпячиваний, складок, инвагинаций), уве­личением количества органелл, активацией метаоболизма. В ядре активация синтеза белков отражается на объеме эухроматина; количестве, размерах и поло­жении ядрышек, площади ядерной оболочки и количестве ядерных пор.

Часто оценивают функциональную активность клеток по наличию и количеству рецепторов к ключевым регуляторам.