Эти маленькие, лишенные оболочки вирусы, содержащие одноцепочечную ДНК, обладают рядом свойств, необходимых хорошему вектору. Они непатогенны, обеспечивают эффективную и стабильную трансфекцию неделящихся клеток, а кроме того, позволяют исключить экспрессию вирусных белков в зараженных клетках. Основные недостатки аденоассо-циированных векторов - маленькая емкость и трудности в концентрировании.
Жизненный цикл. Для репродукции аденоассоциированные вирусы нуждаются в генетической информации вируса-помощника. В жизненном цикле аденоассоциированных вирусов выделяют две фазы. Такой вирус заражает клетку, включается в клеточный геном и в отсутствие вируса-помощника (аденовируса) остается там продолжительное время в латентном состоянии. В присутствии аденовирусов начинается активная фаза, приводящая к репродукции аденоассоциированного вируса и лизису клеток. Геном аденоассоциированного вируса содержит две открытые рамки считывания (гер и cap), ограниченные инвертированными концевыми повторами (ITR). Для репродукции вируса нужны только гены гер, кодирующие четыре белка, которые обеспечивают репродукцию аденоассоциированного вируса, транскрипцию вирусной ДНК и эндонуклеазную активность, необходимую для встраивания в клеточный геном. Структурные белки, образующие капсид вируса, кодируются геном cap. В районе инвертированных концевых повторов находятся точки начала репликации; эти повторы содержат сигналы для сборки вирусов, а также участвуют во встраивании вирусной ДНК в клеточный геном. Функция многих белков и другие особенности биологии вируса стали известны после изучения природных немодифицированных вирусов.
Заражение начинается с прикрепления вируса к его основному рецептору на клетке - протеогликану, содержащему гепарансульфат. В проникновении вируса в клетку участвуют также рецептор фактора роста фибробластов и сц, Р5-интегрин. Интернализация вируса осуществляется путем эндоцитоза через образование покрытых клатрином окаймленных ямок. Внутри клетки геном аденоассоциированного вируса замыкается в кольцо и образует кольцевые конкатемеры, находящиеся вне хромосом. Образование этих кольцевых форм вирусного генома сопровождается длительной экспрессией трансгена. Природный аденоассоциированный вирус может встраиваться в ДНК человека на одном участке 19-й хромосомы (19q 13.3-qter). Рекомбинантный вирус иногда утрачивает эту способность. Конструкция и получение вектора. Существующие аденоассоциированные векторы получают с помощью системы трех рекомбинантных плазмид. Первая плазмида содержит трансген, расположенный между двумя инвертированными концевыми повторами, вторая - гены гер и cap, а третья - участки генома аденовируса, необходимые для сборки аденоассоциированного вируса. Этот подход позволяет обойтись без дополнительного заражения продуцирующих клеток аденовирусом. Из-за небольшого размера генома аденоассоциированных вирусов в вектор можно включить не более 5200 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Это не только ограничивает размер потенциального трансгена, но и затрудняет использование специальных промоторов и энхансеров, регулирующих его экспрессию в зараженной клетке. При использовании двухвекторной системы можно вдвое увеличить емкость вектора: две половины трансгена соединяются in vivo из двух разных векторов, которые объединяются в кольцевой конкатемер внутри клетки. Таким же образом можно собирать большие гены или включать важные регуляторные элементы, слишком большие для одного вектора. В настоящее время основные проблемы в использовании аденоассоциированных векторов связаны с трудностями получения высокой концентрации вектора и определения его титра. Клетки-мишени. Аденоассоциированные векторы способны заражать различные клетки. В доклинических исследованиях показана эффективная трансфекция клеток скелетных мышц, ЦНС, легких, печени, ЖКТ и глаза.
Применение. Аденоассоциированные векторы начали применять в клинике: сейчас проводятся клинические испытания доставки генов в легкие и в скелетные мышцы. По-видимому, эти векторы подходят для обеспечения длительной экспрессии трансгенов в скелетных мышцах, сердце, ЦНС и других тканях. Первые результаты клинического испытания, в котором с помощью аденоассоциированного вектора осуществляли доставку гена фактора IX в скелетные мышцы больных гемофилией, оказались успешными (см. ниже). Способность этих векторов обеспечивать длительную экспрессию трансгенов, не оказывая токсического действия на клетки и не вызывая иммунного ответа, делает их перспективным инструментом лечения некоторых наследственных заболеваний.
Безопасность. Аденоассоциированные вирусы непатогенны. Первые опыты с использованием соответствующих векторов показали, что они не активируют иммунную систему. Раньше высказывались опасения, что аденоассоциированный вектор может быть загрязнен вирусом-помощником (аденовирусом), но этот риск ликвидировали новые схемы получения векторов. Наконец, аденоассоциированные векторы могут встраиваться в геном клетки случайным образом, что теоретически может привести к инсерционному мутагенезу. Вероятно, необходимо сохранить в векторах способность специфического встраивания в 19-ю хромосому
Герпесвирусы
Этот вирус содержит большую (152 000 пар нуклеотидов) молекулу двухцепочечной ДНК, которая реплицируется в ядре зараженной клетки. Вирус заражает различные клетки, как делящиеся, так и неделящиеся; вирусный геном находится вне хромосом. В вирусный геном путем гомологичной рекомбинации или путем делеции и вставки можно встроить до 20 000-30 000 пар нуклеотидов чужеродной ДНК. Вирус простого герпеса типа 1 обладает тропностью к нейронам, поэтому его предложено использовать в качестве вектора для генотерапии нервных болезней, например болезни Паркинсона или злокачественных новообразований мозга. Основные недостатки такого вектора - цитотоксичность и возможность замолкания трансгена.
Жизненный цикл. Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса типа 1, может быть активной, приводящей к лизису клеток, или латентной. При первичном заражении вирус проникает в клетки эпителия (кожи или слизистых), где репродуцируется. Новые вирусы, покидая зараженную клетку путем отпочковывания, получают внешнюю оболочку, состоящую из остатков клеточной мембраны. Затем вирусы внедряются в чувствительные нервы вблизи от очага первичной инфекции и ретроградно транспортируются по волокну в тело нейрона. В прикреплении вируса участвуют молекулы гепарансульфата, расположенные на поверхности клеточной мембраны. Попав в тело нейрона, вирус может продолжить активную репродукцию или перейти в латентное состояние. В последнем случае подавляется экспрессия большинства вирусных генов, но два промотора (LAPI, LAP2) активируют синтез транскриптов, связанных с латентностью (LAT-транскриптов). Позже вирус может реактивироваться, начать активную репродукцию и распространиться на очаг первичной инфекции или ЦНС.
Конструкция и получение вектора. Герпесвирусный вектор не способен к репликации, поскольку у него нет нескольких необходимых для этого генов, таких, как сверхранние гены ICP4, 1СР22и ICP27. Удаление этих генов уменьшает также цитотоксичность вектора и увеличивает продолжительность экспрессии трансгена. Были разработаны методы, позволяющие без использования вирусов-помощников получить герпесвирусные векторы, хотя и с невысоким титром. Такие векторы способны заражать нервные клетки in vivo, не повреждая их. Наиболее эффективные способы получения вектора на основе вируса простого герпеса типа 1 позволяют включить в него два независимых трансгена.
Большим препятствием к использованию герпесвирусных векторов является кратковременность экспрессии, вызванная замолканием трансгена. Перспективный способ преодоления этой проблемы - использование промоторов, активирующих синтез LAT-транскриптов. Иногда для облегчения трансляции трансген сшивают с внутренним сайтом связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита.
Клетки-мишени. Вирус простого герпеса типа 1 способен заражать различные клетки человека, но особенно выражена его тропность к нейронам. Для повышения специфичности удаляют вирусные гены, кодирующие гликопротеид (обеспечивает прикрепление к клетке); их можно заменить на другие аналогичные гены.
Применение. Емкость герпесвирусных векторов очень велика. Например, с их помощью в культуру мышечных клеток, полученных от мышей с экспериментальной мышечной дистрофией, была введена полная кДНК дистрофина из 14 000 пар нуклеотидов. Способные к репродукции герпесвирусные векторы сейчас разрабатываются для лечения злокачественных новообразований мозга и других органов. Безопасность. Основная опасность герпесвирусных векторов - цитотоксичность. Новейшие способы получения векторов, включающие удаление дополнительных вирусных генов, снижают этот риск.
Отсюда следует два важных следствия ГТвоздействия. Вопервых, неотъемлемость ГТ от клеток, и, как следствие, отсутствие генной терап
одной из основных задач генной теM рапии – далее ГТ – является коррекция системы работы генов путем их направленного переноса в организм или определенный тип клеток, тканей. Отличие и, одновременно, преимущество ГТ по сравнению с другими видами терапии заключается в том, что ГТ направлена на устранение причин заболевания, в то время как большинство лекарств устраняет лишь симптомы заболевания. В табл. 1 приведены типы заболеваний, которые на настоящий момент считаются мишенями ГТ. Генная терапия и ее составляющие Минуло чуть более 13 лет с того момента, когда было начато первое испытание ГТвоздействия на детей, дефектных по гену аденозин дезаминазы (ADA). Лекарство для паллиативного лечения стоит 60 000 долларов в год. Это испытание было удачным, в организм вводился аденовирус, который кодировал фермент. Вирус проникал в клетки и генетически модифицированные клетки производили фермент аденозин дезаминазу. Это позволило почти втрое сократить лекарственное лечение. С тех пор минуло уже 13 лет и на следующих диаграммах отражено количетсво пациентов, вовлеченных в ГТиспытания, распределение по заболеваниям, по странам, где эти испытания проводятся (рис. 2). Таблица 1 Заболевания, при которых перспективным считается проведение ГТ Моногенные заболевания Онкологические заболевания Инфекционные заболевания Сосудистые заболевания Другие Микополисахараидозис Наследственная гиперхолестеролимия Гемофилия B (factor IX deficiency) Хронический грануломатоз Меланома Рак предстательной железы Онкогематология и др. СПИД Эпштейна–Барр и цитомегаловирусная инфекции Склероз коронарных артерий Склероз переферических артерий Атеросклероз вен нижних конечностей с трофическими язвами Тромбофлебит Неспецифический язвенный колит Боковой амиотрофический склероз Ревматоидный артрит Заболевание Альцгеймера