Краски и их приготовление




Л Е К Ц И Я

«Окрашивание, просветление и заключение срезов».

Краски и их приготовление

Все употребляемые в гистологии краски по сродству их к тем или иным тканевым элементам делятся на ядерные (основные) и диффузные (кислые). Каждая группа насчитывает значительное количество красящих средств. В условиях работы патологогистологического отделения нет надобности во всей массе имеющихся красок. Для подавляющей части диагностических исследований достаточны такие простые способы окраски, как гематоксилин-­эозин и по Ван-Гизону, и несколько специальных методов (фосфорно-вольфрамовый гематоксилин, судан-III, конго-рот и т. д).

Основные, или ядерные краски. В этой группе наибольшее значение имеют красители, приготовленные из гематоксилина.

 

Гематоксилин является экстрактом кампешевого дерева, имеет вид бурого кристаллического порошка, хорошо растворимого в спирте и плохо в воде. Существует много способов приготовления гематоксилина, но суть их одна – его окисление.

Красящим веществом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления – гематеин (C16H1406). В связи с этим часть гематоксилиновых красок пригодно для работы не сразу после приготовления, а только по истечении некоторого времени, в течение которого происходит окисление гематоксилина в гетеин, что обозначается как «созревание краски». По мере созревания краски возрастает её красящая способность. Созревания требуют только те гематоксилиновые краски, которые готовят без окислителей.

Из квасцовых гематоксилинов, приготовляемых с окислителями и потому сразу окрашивающих, используется гематоксилин Караци и железный гематоксилин Вейгерта.

 

Гематоксилин Караци имеет следующий состав:

Вода дистиллированная – 400мл

Квасцы алюмо-калиевые – 25 г

Гематоксилин кристаллический – 0,5 г

Глицерин – 100 мл

Йодноватокислый калий – 0,03 г

Смесь готовят при комнатной температуре. Вначале она представляет собой светло-фиолетовую прозрачную жидкость, которая через несколько часов становится темно-вишневой и непрозрачной; с этого момента она начинает окрашивать срезы, необходимое время окрашивания – 20-40 минут. В последующие дни красящая способность нарастает спустя 1-2 недели хорошие результаты будут уже через 10-15 минут. В дальнейшем, по мере созревания, краситель может и перекрашивать.

Красящий раствор обладает большой устойчивостью, сохраняется около 10 лет; в первые недели после приготовления можно не фильтровать. Для предупреждения плесени в краску добавляют несколько кристалликов тимола.

Железный гематоксилин Вейгерта (Ван-Гизон) приготавливают из двух основных растворов (Вейгерт 1 и Вейгерт 2) только по мере надобности.

Раствор Вейгерт 1 представляет собой 1 % раствор гематоксилина в 960 спирте (на 100 мл 1 г).

Раствор Вейгерт 2 имеет следующий состав: 4 мл крепкой хлористоводородной кислоты и добавляют 95 мл дистиллированной воды.

Этот раствор желательно готовить на срок не более 3-4 месяцев.

Перед употреблением смешивают точно поровну оба раствора в маленьком градуированном цилиндре; получается густая темно-фиолетовая смесь. Свежеприготовленная смесь обладает высокой красящей способностью, интенсивно окрашивает срезы в течение 3-5 минут. Правильно приготовленный раствор железного гематоксилина должен отличаться известной стойкостью и не изменять цвета около 40-60 минут. В последующие часы такая краска становиться тёмно-вишнёвой с коричневым оттенком, а со 2-3-го дня постепенно буреет, сохраняя этот цвет несколько недель. Лучше всего пользоваться смесью сразу после приготовления, однако если она была хорошо приготовлена, то, несмотря на бурение, её с большим успехом можно использовать повторно, не прибегая к фильтрованию еще 1-2 недели.

Краска, в которой появился хлопьевидный осадок, негодная для повторного употребления.

Если свежеприготовленная краска начинает буреть и приобретать зеленоватый оттенок сразу или вскоре после приготовления (в течение 5-10-20 минут), то она считается негодной, ибо приводит в дальнейшем и бурой и зеленоватой окраске ядер, в то время как нормально они должны быть черными. Такое преждевременное побурение и позеленение краски обычно связано с преобладанием в смеси второго раствора (Вейгерт 2).

Следует помнить, что при смешивании по каплям таких растворов, как Вейгерт 1 и 2, для получения равных объемных отношений необходимо брать первого раствора в 2 раза больше капель, чем второго. Например, на 2 капли второго – нужно взять 5 капель первого раствора. Это объясняется разницей поверхностных натяжений этих растворов (один – спиртовой, другой – водный), в силу чего капли их неодинаковы по объему. Понятно, что пипетки для них должны быть одинаковыми. Можно пользоваться и одной пипеткой, но тогда, перед тем как набирать краску, пипетку каждый раз надо тщательно промывать в дистиллированной воде.

Все гематоксилиновые красители окрашивают ядра в темно-синий (квацевые) или черный (железный гематоксилин) цвет.

Кислые краски. Из диффузных красок постоянное применение имеют эозин, кислый фуксин и пикриновая кислота. Последние две краски употребляются в специальной смеси друг с другом, называемой пикрофуксином или смесью Ван-Гизона.

Эозин – синтетический краситель, тетерабрампроизводное флуоресцина.

Выделяется в виде натриевой, калиевой или аммониевой соли. Различают много сортов эозина, из них наибольшее распространение имеют: эозин желтый (растворимый вводе), голубоватый (растворимый в спирте), эритрозин (растворимый только в спирте). Употребляются эозины в 0,25-0,5% водных или спиртовых растворах. Для приготовления спиртовых растворов можно пользоваться любыми сортами эозина и брать спирт различной крепости (от 40° до 70°); они окрашивают сильнее водных. Иногда пользуются растворами эозина, подкисленными уксусной кислотой, примерно из расчета 1 капля крепкой уксусной кислоты на 100 л раствора эозина. Подкислять лучше спиртовые растворы эозина, так как водные (подкисленные) с течением времени могут мутнеть и давать осадки. Такие подкисленные растворы показаны в том случае, когда ткани плохо воспринимают обычный (неподкисленный) краситель.

Растворы эозина розового цвета, в такой же цвет они окрашивают и ткани. Сроки окрашивания весьма различны (от 5-10 секунд до 3-5 минут) и зависят от сорта, способа приготовления и процентного содержания красителя.

Пикрофуксин. Готовят из насыщенного при комнатной температуре водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого (не основного) фуксина (при комнатной температуре в 100 мл дистиллированной воды растворяется около 12 г пикриновой кислоты).

Оба раствора смешивают из расчета 10 мл пикриновой кислоты на 1 мл фуксина. Получается жидкость гранатового цвета. Особенностью этой смеси является то, что разные ткани она окрашивает различно и этим значительно облегчает их исследование. Каждая ткань воспринимает из этой смеси только одну составную часть краски и именно ту, которая обладает наибольшим сродством к ней. Так, соединительная ткань лучше всего воспринимает кислый фуксин и потому окрашивается в ярко-красный цвет. Мышечная ткань (поперечнополосатая и гладкая), эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в желтый цвет и цитоплазма различных клеток. Данное обстоятельство имеет весьма важное дифференциально-диагностическое значение, и в этом большое преимущество пикрофуксина перед эозином, одинаково закрашивающим все ткани.

Пикрофуксин требует тщательного приготовления. Помимо точного соблюдения соотношений указанных компонентов, краску иногда приходится подгонять по контрольным препаратам, добавляя в неё то одну, то другую составную часть. Так, если преобладает фуксин, то доливают пикриновую кислоту и наоборот. Правильно приготовленная краска отличается тем, что её составные части дают на тканях, к которым они обладают небольшим сродством, лишь свой совершенно чистый тон и не забивают друг друга.

Все краски для гистологических работ готовят обязательно на дистиллированной воде.

Способы окрасок

В гистологической технике в зависимости от числа применяемых красящих средств различают следующие виды окрасок:

– простую (применяется одна краска),

– двойную (две краски)

– тройную, или сложную (три краски).

Во всех этих окрасках главная роль принадлежит ядерной (основной) краске, которая употребляется либо одна, либо в комбинации с кислыми (одной или несколькими).

Наиболее распространены комбинированные окраски, здесь возможны самые разнообразные сочетания. В патологогистологической практике широко применяются гематоксилин в комбинации с эозином (двойная) и гематоксилин с пикрофуксином (тройная). Последняя окраска известна под именем Ван-Гизона.

Окрашивание препаратов в обоих случаях идет по одной и той же схеме и состоит в последовательном применении сначала ядерной, а затем кислой краски с промыванием в воде после каждой из них.

Также существуют и другие типы окрашивания:

Прогрессивное окрашивание – способ, при котором срезы находятся в красителе до тех пор, пока не достигнут требуемого уровня окрашиваемости.

Регрессивное – срезы вначале перекрашивают, а затем доводят до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо выделить отдельные элементы тканей.

Следует постоянно помнить:

а) о тщательном удалении отмывающей жидкости (в противном случае она будет продолжать действовать и исказит результат окраски);

б) о предпочтительном применении тонких срезов;

в) о том, что разведенные красители дают лучшие результаты, чем крепкие растворы (толстые срезы и высокая концентрация красителя затрудняют дифференцировку и приводят к неравномерной окраске срезов);

г) окраску нужно проводить под контролем микроскопа.

Прямое окрашивание – окрашивание объекта непосредственно в растворе красителя;

Непрямое (протравная) – срез окрашивают нужным красителем лишь после предварительной обработки специальными протравными красителями.

Все методы гистологического окрашивания можно разделить на две основные группы:

а) обзорные, используемые для получения общего ориентировочного представления об изучаемом объекте (окрашиваются преимущественно ядра и цитоплазма клеток);

б) специальные, которые позволяют окрашивать именно те тканевые и клеточные элементы, которые интересуют исследователя.

Для того чтобы получить хорошие результаты при любом методе окраски гистологических препаратов, необходимо соблюдать определенные правила:

1. Красящие растворы должны быть чистыми, поэтому любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде;

2. Отдавать предпочтение: а) окрашиванию красителями низкой концентрации в течение длительного времени перед кратковременной окраской красителями высокой концентрации;

б) применению регрессивных методов.

Тщательно выполнять все процедуры при подготовке среза к окраске и последующей его обработке.

Проведение окрашивания

При окраске водными красителями срезы переносят из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми – из спирта соответствующей концентрации, непосредственно в красящий раствор (прямое окрашивание) или сначала в жидкость для протравки (непрямое окрашивание). Когда препарат приобретает

нужную интенсивность окраски, его промывают в воде (или спирте) для удаления избытка красителя, а затем, если нужно, дифференцируют в соответствующей жидкости. Излишний краситель отмывают до тех пор, пока он не перестает переходить из среза в отмывающую жидкость.

Окрашивание срезов, наклеенных на стекло, проводят путем помещения их в красящий раствор. Для этого специальные кюветы, позволяющие красить одновременно большое количество стекол, проводят по схеме в высоких стаканчиках с краской.

Для того чтобы окрашенный препарат можно было исследовать в проходящем свете и дольше хранить, он должен быть прозрачным и защищен от высыхания, загрязнения и повреждения.

Все эти условия обеспечивают просветлением и заключением препарата в специальные срезы.

Просветление и заключение срезов

Просветление делает препараты прозрачными, проходимыми для лучей света и потому удобными для исследования. Различают две группы просветляющих веществ в зависимости от того, способны ли они просветлять срезы после извлечения их из воды или только после обезвоживания спиртом.

Первую группу веществ, т.е. просветляющих срезы после воды, составляет глицерин, глицерин-желатина и т. д. и ряд сложных специально приготовленных сред, как то: фаррактова жидкость, масса Апатии. Подобные просветляющие вещества обычно употребляют при некоторых специальных методах исследования, например на липиды, амилоиды. В этом случае окрашенный срез извлекают из воды на предметное стекло, расправляют, удаляют избыток воды вокруг среза тряпкой, кладут каплю глицерина или другое просветляющее вещество из этой группы и покрывают покровным стеклом. Можно применять этот метод и для различных ориентировочных исследований.

Ко второй группе веществ (просветляющих срезы после спирта) относятся ксилол, толуол, эфирные масла, карболксилол, карболтолуол и т. д.

Для просветления срезов чаще всего пользуются веществами второй категории, так как они обладают более высоким просветляющим эффектом и дают прочные препараты. По этой последней причине срезы после окрашивания подвергают спиртовой обработке, то более, то менее тщательной смотря по тому, с каким просветляющим средством приходится работать.

Так, например, ксилол и толуол весьма чувствительны к качеству обезвоживания срезов и поэтому здесь показано применение абсолютного спирта. Креозот, эфирные масла, карболксилол в этом отношении менее чувствительны, они легко просветляют и после 960 спирта. Все просветляющие вещества обладают теми или иными неблагоприятными свойствами, проявляющимися иногда при длительном хранении препаратов. Один из них вызывает пожелтение препаратов (креозот), другие сильно морщат срезы (ксилол, толуол, карболксилол) и, наконец, почти все они, за исключением ксилола и толуола, в той или иной степени извлекают различные синтетические (анилиновые) красители и поэтому имеют ограничения.

На основании вышеизложенного, делаем вывод, что большим достоинством ксилола и толуола является их абсолютно индифферентность к любым красителям.

В практической работе при простых окрасках (гематоксилин-эозин, по Ван-Гизону) и многих специальных методах исследования для целей просветления удобнее всего пользоваться комбинацией просветляющих средств, т. е. просветлять срез вначале веществом, не требующим абсолютного спирта (эфирное масло, креозот, карболксилол), а затем быстро в течение 1 минуты, обрабатывать ксилолом, применяя его повторно. В просветляющем веществе срез держат до тех пор, пока он не станет совсем прозрачным. На черном фоне стола непросветленные участки среза представляют в виде беловатых пятен. Эта операция занимает от 15-20 секунд до нескольких минут. Быстрота просветления препарата зависит от крепости употреблявшегося спирта и тщательности обработки им. При неудовлетворительной спиртовой обработке, а также для более скорого просветления показано повторное применение просветляющего вещества, которое в этом случае часто комбинируют с быстрым просушиванием среза втрое или вчетверо сложенной фильтровальной бумагой.

Просветленные и обработанные ксилолом срезы заключают в специальные срезы.

Для заключения гистологических срезов используют такие вещества, как канадский и пихтовый бальзамы, канифоль, гумми - сироп, глицерин и др. Одни из них являются веществами дефицитными, другие обладают существенными недостатками.

Применение пластических масс для заключения гистологических срезов позволяет отказаться от всех перечисленных выше веществ и от покровных стекол, т. к. пластмасса пропитывает срез и одновременно покрывает его тонким слоем сверху, заменяя тем самым покровное стекло.

Полистирол

Полистирол представляет собой пластическую массу, растворимую в ксилоле, бензоле, толуоле и потому пригодную для заключения срезов, окрашенных гематоксилин - эозином, по Ван-Гизону и т. п. С завода полистирол получают в виде отдельных, твердых, прозрачных кусочков.

Для заключения гистологических срезов следует пользоваться 30% раствором полистирола в ксилоле (толуоле), который имеет консистенцию густого меда и совершенно прозрачен. Хранить его надо в банке с притертой пробкой во избежание испарения ксилола и загустения раствора. Если последний со временем станет слишком густым, к нему добавляют ксилол, если же раствор окажется жидким, нужно дать возможность улетучится части растворителя. При нанесении раствора полистирола на стекло черезминут образуется прозрачная прочная пленка. В быстроте образования пленки состоит большое преимущество полистирола: однако пленка обладает существенными недостатками: она хрупкая, ломкая и плохо прилегает к стеклу. Для устранения этих недостатков к раствору полистирола необходимо добавить так называемый пластификатор - вещество, придающее эластичность и гибкость полистироловой пленке, а также значительно увеличивающее её способность прилипать к стеклу. В качестве пластификатора следует применять дибутилсебацинат.

Дибутилсебацинат представляет собой бесцветную маслянистую жидкость, которая при обычной температуре практически не испаряется и придает эластичность и гибкость полистироловой пленке и очень долгое время. В готовый раствор полистирола следует добавить пластификатор в таком количестве, чтобы раствор последнего в полистироле был равен 6% (т. е. на 100 мл раствора полистирола добавляется 6 мл пластификатора). Скорость образования пленки при добавлении пластификатора почти не изменяется (она образуется через 40-60 минут), однако пленка получается эластичной, не трескается, не ломается и плотно прилегает к предметному стеклу.

Методика заключения срезов в полистирол: рез, извлеченный на предметное стекло из карболксилола, покрывается несколькими каплями раствора полистирола. Наносить раствор можно стеклянной палочкой из маленькой бутылочки, куда предварительно наливается небольшое количество полистирола из основного запаса раствора и равномерно распределяется по стеклу. Пока не образовалась прочная сухая пленка, срез следует предохранять от попадания пыли.

После данных процедур препарата можно исследовать под световым микроскопом. Помещенные под стекло срезы для светового микроскопа могут долго хранится и многократно использовать.

Заключение

Гистологическое исследование аутопсийного, биопсийного материала, а также органов тканей, удаленных при хирургических операциях ставит перед собой цель определения характера патологического процесса. Значение этого метода исследования трудно переоценить, так как он позволяет уточнить диагноз, определить морфологические особенности патологического процесса. На основании полученных данных врач имеет возможность избрать наиболее правильную тактику лечения больного. Особенно важное значение имеет биопсия при определении опухолей, когда малейшая невнимательность и неточность могут послужить причиной роковой ошибки. При работе с биопсийным материалом от лаборанта-гистолога требуется предельная собранность и четкость.

 



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2019-10-17 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: