В Номенклатуру и классификацию ферментов внесено большое количество протеолитических ферментов микробного происхождения, которые относятся к различным подподклассам: 3.4.11 (7 ферментов), 3.4.13(5), 3.4.15(1), 3.4.16(1), 3.4.17(5), 3.4.21(4), 3.4.22(3), 3.4.23(1), 3.4.24(4) и 3.4.99(4). Необходимо отметить, что часто под одним номером находится очень много ферментов, получаемых из различных источников, но имеющих сходные свойства. Так, в подподклассе 3.4.21.14 представлена целая серия микробных протеиназ, среди продуцентов которых отмечаются Bacillus subtilis, E. coli, щелочная протеиназа из культур рода Aspergillus, Tritirachium album, Arthrobacter, Pseudomonas aeruginosa, Malbranchea pulchella, Streptomycer rectus, Candida lipolytica и др. Под номером 3.4.23.6 также объединено много ферментов, источниками которых являются микроорганизмы, в основном относящиеся к грибам родов: A. oryzae, A. terricola, A. saitoi, A. niger, P. janthinellum, R. chinensis, M. pusillus, M. miehei, Endothia parasitica, Candida albicans, Saccharomyces carlsbergensis, Rhodotorula glutinis, Physarum polycephalum и др. Все микробные металлопротеиназы объединены под номером 3.4.24.4. Они выделены из культур родов: Streptomyces, Sarcina, Micrococcus, Staphylococcus, Bacillus, Aeromonas, Pseudomonas, Escherichia, Aspergillus, Myxobacter, Serratia.
Однако в промышленности чаще всего получают комплекс протеолитических ферментов, достоинства которого определяются с учетом последующего применения ферментного препарата. Суммарная протеолитическая активность такого препарата определяется на соответствующем субстрате: гемоглобине, желатине, растительном белке, эластине, коллагене и т. д.
Технологические схемы производства микробных протеиназ
Технологические схемы производства микробных протеиназ (см. рис. 1 и 5) отличаются друг от друга прежде всего на первой стадии получения микробной культуры продуцента, на стадиях выделения различия меньше.
Продуценты
В качестве продуцентов протеолитических ферментов при глубинном культивировании в промышленных условиях используют бактерии в основном рода Bacillus, реже – актиномицеты и микроскопические грибы. Способность к образованию протеолитических ферментов отмечается практически у всех известных микроорганизмов, так как роль этих ферментов в регуляции жизненных функций организмов очень велика. Протеолитические ферменты в подавляющем большинстве случаев являются внеклеточными.
2.3.3 Регуляция синтеза протеиназ
В самом общем виде гипотетический механизм регуляции биосинтеза внеклеточных протеаз у микроорганизмов представлен на рисунке 14. Авторы этой модели, основываясь на данных литературы и собственных исследованиях, предполагают, что иРНК-экзопротеазосинтезирующая система безуспешно конкурирует с системами других РНК вследствие низкого сродства специфических факторов инициации или РНК-полимеразы с участком инициации на экзобелковом гене. Известно, что синтез РНК контролируется либо соотношением ненагруженных и аминоацилированных тРНК (при этом свободные тРНК являются репрессорами синтеза), либо действием гуанозинтетрафосфата (ppGpp), который образуется при аминокислотном голодании и подавляет биосинтез РНК. Суть предлагаемой модели заключается в следующем. Присутствие в среде в достаточном количестве всех необходимых аминокислот и других источников углерода, азота и серы позволяет поддерживать внутриклеточный пул микроорганизма на высоком уровне. При этих условиях клетка осуществляет интенсивный синтез нетранслируемых РНК и иРНК для внутриклеточных белков. В результате содержание свободных факторов инициации РНК-полимеразы, которые могут принять участие в синтезе иРНК экзопротеаз, незначительно. Вероятно, этим объясняется низкая частота транскрипции иРНК экзопротеаз и, следовательно, низкий уровень образования внеклеточных протеаз, например, в начале роста культуры на такой сбалансированной среде (левая сторона схемы).
Истощение среды в процессе роста культуры по одному или нескольким субстратам приводит к снижению уровня пула внутриклеточных свободных аминокислот, что значительно снижает синтез РНК. В результате освобождаются РНК-полимераза и факторы инициации транскрипции РНК. Увеличиваются частота инициации иРНК экзопротеаз и соответственно синтез внеклеточных протеолитических ферментов (правая сторона схемы). При наличии в среде белков экзопротеазы расщепляют их до пептидов и аминокислот, которые поступают в клетку, пополняя ее пул. Аминокислоты утилизируются клеткой активно и являются лимитирующим субстратом. Поступающие в клетку аминокислоты могут полностью удовлетворить ее потребности, т. е. снять лимитирование по этому субстрату, что приведет к временному торможению биосинтеза экзопротеаз и т. д. Иными словами, имеет место механизм контроля синтеза экзопротеаз по типу метаболитной репрессии. Можно предположить, что регуляторное воздействие субстратов на биосинтез экзопротеаз проявляется на уровне транскрипции. Известно, что пул иРНК поддерживает синтез протеаз в течение нескольких часов.
Глубинным способом культивируют многие продуценты протеолитических ферментов. Для производства нейтральных и щелочных протеиназ используют спороносные бактерии и актиномицеты, для получения кислых – микроскопические грибы.
Наиболее широко в нашей стране применяются штаммы бактерий, относящиеся к видам Bacillus subtilis и В. mesentericus, на основе которых выпускаются препараты протосубтилин и протомезентерин разной степени очистки, предназначенные для самых различных отраслей – от пищевых технологий до использования в моющих средствах и сельском хозяйстве.