Уже несколько лет известно, что электрические реакции в волосковых клетках возникают благодаря деформации волоскового пучка, однако для непосредственного экспериментального подтверждения этого потребовалась разработка чувствительной аппаратуры, которая могла бы вызвать и измерить ничтожно малые перемещения при отведении от волосковых клеток. Слуховой и вестибулярный эпителий холоднокровных позвоночных, таких как черепахи и лягушки, оказался наиболее удобным для проведения таких опытов. Процедуры, использованные Кроуфордом и Феттиплейсом для стимуляции волосковых клеток в базальном сосочке (basilar papilla) черепахи (слуховой эпителий, аналог органа Корти у млекопитающих). Базальные сосочки были извлечены из внутреннего уха и помещены в солевом растворе в камеру, смонтированную на предметном столике микроскопа. Микроэлектрод записывает потенциал мембраны волосковой клетки, в то время как стекловолокно, прикрепленное к пьезоэлектрическому манипулятору, давит на пучок волосков. Проецируя изображение стекловолокна на пару фотодиодов, можно уловить смещения всего на 1 нм. Такой стимул производит в волосковой клетке изменение потенциала величиной в 0,2 мВ.
Хадспет и его коллеги детально описали процесс трансдукции в вестибулярных волосковых клетках лягушки. В одной из серий экспериментов они непосредственно продемонстрировали функциональную ориентацию волоскового пучка, варьируя направление стимуляции, осуществляемой пьезоэлектрическим манипулятором. Отклонения в сторону киноцилия деполяризовали клетку, тогда как движение от него приводили к гиперполяризации. Отклонение пучка в направлении, перпендикулярном этой оси, не вызвало изменений мембранного тока. Величина изменения потенциала, генерируемого в волосковой клетке, изменяется в зависимости от угла отклонения пучка.
Концевые связи и воротные пружины
Какая структурная особенность волоскового пучка могла бы лежать в основе ориентационной избирательности трансдукции? Пикльз и коллеги, используя сканирующий электронный микроскоп, описали уникальный класс внеклеточных связей, соединяющих верхушки одного волоска с боковой поверхностью соседнего, более длинного волоска. Эти концевые связи наблюдались только вдоль оси механической стимуляции (т. е. ориентированы вверх и вниз по «лестнице»). Положение концевых связей позволяет предположить, что они могут быть вовлечены в механотрансдукцию, а воздействие, разрывающее концевую связь, должно прекращать трансдукцию. Действительно, внеклеточные отведения указывают на то, что каналы, активируемые механическим стимулом, расположены вблизи вершины волоскового пучка.
Количественные измерения трансдукции и идентификация концевых связей были объединены в гипотезе воротной пружины (gating spring), описывающей механизм механотрансдукции в волосковых клетках. Отклонение волоскового пучка в «позитивном» направлении (в сторону более высоких волосков) увеличивает расстояние между концами волосков, растягивает воротную пружину, открывая таким образом ворота каналов трансдукции. Когда пучок смещается в сторону, противоположную более длинным волоскам, происходит сжатие пружины, и каналы закрываются. Хотя такая схема может показаться достаточно идеализированной, однако требование прямой физической связи между механикой пучка и открыванием канала диктуется огромной скоростью, с которой в волосковых клетках происходит трансдукция, имеющая постоянную времени открывания около 40 мкс. К тому же энергетика и механика трансдукции согласуются с данной моделью. Например, можно измерить уменьшение жесткости пучка по мере того, как открываются каналы трансдукции, так, будто это молекулярное движение действительно снимает напряжение с воротной пружины. Каналы трансдукции в волосковых клетках
Какого типа каналы открываются на концах волосковых клеток? Оказалось, что это неизбирательные катионные каналы, имеющие значительную кальциевую проводимость. Проводимость одиночного канала - около 100 пСм. На основании этих данных, а также измерений величины общего генераторного тока можно рассчитать, что каждая волосковая клетка имеет около 100 каналов трансдукции. Это соответствует всего нескольким каналам на один стереоцилий.
Очень малое количество каналов в каждой волосковой клетке существенно затрудняет их биохимическое и молекулярно-биологическое исследование. Каналы трансдукции волосковых клеток не являются потенциалзависимыми и не открываются какими-либо лигандами в традиционном смысле этого слова. Поэтому маловероятно, что возможна жесткая гомологичность между ними и другими классами управляемых ионных каналов, для которых гены уже описаны. Однако все больше механочувствительных ионных каналов клонируется из бактерий, дрожжей, нематод и мух, так что гены-претенденты, скорее всего, будут определены в ближайшем будущем.