Теоретический материал для подготовки к занятию




Молекулярные основы наследственности. Период между открытием единиц наследственности и выявлением их материальной сущности был довольно длительным. Ни Г. Мендель, сумевший на частном примере наследования единичных признаков у гороха открыть единый для всего живого принцип переноса единиц наследственности (генов) от родителей к потомству, ни Г. де Фриз, К. Корренс и Э. Чермак, переоткрывшие законы Менделя, ни цитологи В. Ру, Т. Бовери, В. Сэттон, ни даже создатели хромосомной теории наследственности Т. Морган и его школа, получившие строгие доказательства локализации генов в виде дискретных единиц в хромосомах, ничего не знали о химической природе генов. Вместе с тем основное вещество наследственности - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - было открыто швейцарским врачом и химиком Р. Мишером еще в 1868 г., т.е. всего через три года после опубликования работ Менделя, знаменующего собой рождение генетики как науки. Понадобилось около 80-ти лет, чтобы установить роль ДНК как главного носителя наследственной информации.

Особое значение в формировании представления о функциях генов имела гипотеза, предложенная крупнейшим советским биологом Н.К. Кольцовым. По этой гипотезе, роль различных генов в наследственности и их влияние на жизнедеятельность клеток и организмов основываются на общем свойстве - способности к точной редупликации, т.е. созданию своих копий. Хотя Кольцов, не зная истинной материальной сущности генов, и считал их белками, его идея о том, что гены способны самокопироваться, оказалась совершенно правильной. В это же время Г. Бидл, Б. Эфрусси, Дж. Холден и др. исследователи заложили основу для понимания функционального значения генов и развили классическую концепцию гена, дополнив ее важным постулатом: гены осуществляют свои функции посредством белков-ферментов. Раскрытию функций генов и обнаружению их материальной основы в значительной степени способствовало использование в качестве объектов генетических исследований прокариот - одноклеточных организмов, не имеющих отграниченного ядра и митохондрий и не способных к митозу и мейозу, а также вирусов, особенно вирусов бактерий - бактериофагов.

Роль нуклеиновых кислот как носителей генетической информации. Большую роль в выяснении химической природы генов сыграли опыты Ф. Гриффита (1928), обнаружившего у пневмококков (Streptococcus pneumonia) явление трансформации. Известно несколько типов пневмококков, различающихся по виду и размеру колоний, наличию или отсутствию плотной полисахаридной капсулы, защищающей их от фагоцитоза. При росте на питательной среде пневмококки, окруженные капсулой, образуют крупные гладкие колонии. Такие пневмококки, отнесенные к типу S (от англ. smooth - гладкий), являются возбудителем пневмонии у человека и некоторых животных, в том числе мышей. Примерно одна из 107 клеток пневмококков может спонтанно превратиться (мутировать) в форму, лишенную полисахаридной капсулы. Бескапсульные пневмококки непатогенны, поскольку быстро уничтожаются путем фагоцитоза в организме зараженного животного или человека. На поверхности питательной среды такие бактерии, отнесенные к типу R (от англ. rough - шероховатый), образуют мелкие шероховатые колонии, которые легко отличить от гладких колоний, образуемых пневмококками типа S. Пневмококки, кроме того, различаются по типу поверхностных антигенов, определяемому особенностями капсульного липополисахарида (например, тип IIIS, IIR и др.), что служит еще одним важным признаком, наследующимся в потомстве. Введение мышам убитых нагреванием пневмококков типа IIIS, либо живых пневмококков типа IIR, не вызывало гибели животных. Напротив, введение живых бактерий типа IIIS, как и предполагалось, привело к развитию тяжелой пневмонии и гибели большинства зараженных мышей. Неожиданными оказались результаты опытов, в которых мышам вводили смесь убитых бактерий типа IIIS и невирулентных пневмококков типа IIR. В этом случае многие животные также погибли от пневмонии, а из организма погибших мышей были высеяны живые пневмококки типа IIIS. Такое превращение некапсульных форм бактерий в вирулентные капсульные не зависело от организма хозяина, поскольку наблюдалось и в опытах in vitro, когда в пробирку, содержащую живые R-клетки, добавляли убитые клетки типа IIIS, либо экстракты из них. В обоих случаях при высеве бактерий из пробирок на чашки Петри с питательной средой формировались не только шероховатые колонии, образованные бескапсульными бактериями, но обнаруживались и гладкие колонии, состоящие из клеток капсульных бактерий. Частота появления последних значительно превышала частоту спонтанного мутирования бактерий из IIR-типа в IIIS-тип.

Эксперименты Гриффита выявили существование некоего “трансформирующего начала”, превращающего клетки пневмококков типа IIR в клетки типа IIIS. Однако сами по себе эти эксперименты не выявили химической природы вещества, обеспечивающего стойкое, наследуемое в потомстве превращение бактерий одного типа в другой. Это было сделано спустя 16 лет, когда О. Эвери, К. Мак-Леод и К. Мак-Карти (1944) показали, что если ДНК, выделенную из убитых нагреванием пневмококков типа IIIS, смешать с живыми бактериями типа IIR, то последние приобретают способность формировать на агаре гладкие крупные колонии, состоящие из бактерий типа IIIS. Следует иметь в виду, что в 20-40 гг. нашего века господствовало представление, согласно которому основным веществом наследственности является белок. Поэтому для доказательства того, что ДНК действительно являлась трансформирующим началом в опытах Гриффита, препараты ДНК из пневмококков типа IIIS делили на порции, каждую из которых обрабатывали дезоксирибонуклеазой (ДНК-азой), рибонуклеазой или протеазой - ферментами, разрушающими соответственно ДНК, РНК или белки, а затем применяли для трансформации клеток типа IIR в тип IIIS. Оказалось, что только обработка ДНК-азой полностью снимала трансформирующую активность препаратов ДНК. С другой стороны, по мере очистки ДНК от примесей белка частота трансформации увеличилась. Эта очистка была доведена до такой степени, что в препарате ДНК, полностью сохранившем трансформирующую активность, белка было в 10 тыс. раз меньше, чем ДНК. Обе группы фактов явились доказательством того, что генетическая информация, кодирующая капсульный полисахарид и его антигенную специфичность у пневмококков, находится в ДНК. Дальнейшее развитие этот важнейший вывод получил в экспериментах А. Херши и М. Чейз (1952). В качестве объекта генетических исследований был использован один из вирусов бактерий - бактериофаг Т2, состоящий лишь из белковой оболочки или чехла - капсид, и упакованной в него молекулы ДНК. Для доказательства проникновения ДНК в бактериальные клетки, инфицированные фаговыми частицами, впервые были использованы радиоактивные изотопы, избирательно включающиеся в молекулы ДНК или белка. Заражение бактериальных клеток фагами приводит к резкой перестройке метаболического аппарата хозяина, направленной на обеспечение репродукции фага. Процесс этот происходит очень быстро, так что в некоторых случаях от момента заражения клетки до выхода из нее сотен вновь образовавшихся частиц зрелого фага (потомства лишь одной фаговой частицы, генетический материал которой проник в бактерию), проходит лишь 15-20 минут. К таким высокоинфекциозным фагам относится и фаг Т2, размножающийся в клетках бактерии кишечной палочки (Escherichia coli). Вся репродукция фага Т2 происходит внутри клетки E.coli. Однако оставалось неизвестным, проникает ли в момент заражения в клетку вся фаговая частица, либо только какая-то ее часть. Фаговые ДНК и белки были помечены соответственно изотопами 32Р и 35S путем размножения фаговых частиц на клетках E.coli, выращиваемых в среде, содержащей один из указанных изотопов. Такая специфическая метка дает возможность проследить за поведением каждого компонента фаговой частицы - белка и ДНК. Фаги Т2, меченные по 32Р либо по 35S, по отдельности смешивали на несколько минут с клетками, чтобы дать фаговым частицам адсорбироваться на бактериях. Затем клетки с прикрепленными к ним мечеными фагами резко встряхивали на специальном аппарате - блендере, или смесителе Уоринга. Такое воздействие позволяет отделить компоненты фага, проникшие внутрь бактериальной клетки, от оставшихся снаружи. Последующим центрифугированием инфицированные клетки осаждались на дне пробирок, в то время как компоненты фага, не проникшие в клетку и отделенные от нее встряхиванием, оставались в надосадочной жидкости. Определение радиоактивности в осадке и надосадочной жидкости дало резко отличающиеся результаты в зависимости от того, какие из меченых частиц были взяты в эксперимент. В случае использования фагов, ДНК которых метились по 32Р, практически вся радиоактивность оказалась в осадке, т.е. в клетках. При использовании же фагов, меченных по 35S, основная часть радиоактивности оказалась вне клеток в надосадочной жидкости. Эти данные показали, что во время инфекции в клетку проникает преимущественно фаговая ДНК и, следовательно, именно ДНК необходима для образования фагового потомства. Позднее, когда из E.coli научились получать протопласты, т.е. клетки с удаленной стенкой, способные инфицироваться не целыми фаговыми частицами, а чистой фаговой ДНК, удалось окончательно доказать, что генетический материал Т2 и других фагов, содержащих ДНК и белок, полностью сосредоточен в ДНК. Эта ДНК содержит генетическую информацию, необходимую для репродукции фагов внутри клеток. Репродукция включает синтез новых фаговых белков для упаковки в них этих ДНК. Процесс инфекции клеток с помощью изолированных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, получил название трансфекции.

Опыты Эвери с соавторами на бактериях, а также опыты Херши и Чейз на фаге Т2, позволили сделать заключение, что, по крайней мере, у этих объектов ДНК служит хранилищем генетической информации. Вместе с тем у многих вирусов ДНК отсутствует и вместо нее в белковый чехол упакована РНК. Может ли РНК служить генетическим материалом, т.е. определять строение и функции вирусных частиц? Положительный ответ на этот вопрос был получен Х. Френкель-Конратом и Б. Зингером (1957), работавшими с вирусом табачной мозаики (ВТМ). Ими показано, что РНК, а не белок родительского штамма ВТМ, определяет белковый состав и характерные признаки вирусного потомства, т.к. содержит необходимую для этого генетическую информацию.

Рассмотренные примеры свидетельствуют о том, что генетическим материалом живых организмов являются нуклеиновые кислоты, в большинстве случаев ДНК и, как исключение, РНК. Косвенно такое заключение подтверждают данные о неизменности и видоспецифичности содержания и состава ДНК в клетках животных и растений, а также факт уменьшения вдвое количества ДНК в гаплоидных гаметах с восстановлением его исходного уровня в диплоидной зиготе.

Структура нуклеиновых кислот. Доказательства генетической роли ДНК не отвечали, однако, на не менее важный вопрос: каким образом ДНК осуществляет две свои главные функции? Первая из них, аутокаталитическая, обуславливает способность ДНК к редупликации, или самоудвоению. Другая, гетерокаталитическая, определяет способность ДНК кодировать генетическую информацию, необходимую для того, чтобы образующееся потомство сохранило видовые признаки родителей. Прежде чем получить ответ на этот вопрос, рассмотрим, что было известно о структуре ДНК до 1953 г., когда Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили свою модель двойной спирали ДНК, положившую начало изучению основ генетики на молекулярном уровне.

Нуклеиновые кислоты представляют собой макромолекулы, образованные повторяющимися структурами- нуклеотидами. Каждый нуклеотид состоит из трех компонентов: циклического азотсодержащего соединения, называемого основанием, сахара пентозы, включающего пять атомов углерода, и фосфорной кислоты. Известны пять главных азотистых оснований. Одно из них, урацил (2,6-оксипиримидин), обнаруживается только в РНК. Другое, тимин (2,6-окси-5-метилпиримидин), находится, как правило, только в ДНК. Остальные три основания: цитозин (6-амино-2-оксипиримидин), аденин (6-аминопурин) и гуанин (2-амино-6-оксипурин) - присутствуют как в ДНК, так и в РНК. Двуциклические основания - аденин и гуанин - относятся к пуринам, моноциклические основания - цитозин, тимин и урацил - к пиримидинам. Наряду с этими главными азотистыми основаниями в ДНК некоторых организмов обнаружены минорные редко встречающиеся основания: 5-метилцитозин, 5-оксиметилцитозин и др.

Сахар пентоза, входящий в состав РНК, является рибозой, а входящий в состав ДНК - 2-дезоксирибозой (отсюда и название этих кислот - рибонуклеиновая и дезоксирибонуклеиновая). Часть нуклеотида, состоящая из сахара с присоединенным к нему азотистым основанием, обозначают как нуклеозид. Поэтому нуклеотиды называются также нуклеозидмонофосфатами.

Молекула РНК состоит из одной цепи, в которой последовательно чередуются четыре возможных нуклеотида. Молекула ДНК имеет более сложную структурную организацию. Существенное значение для понимания строения ДНК имели установленные Э. Чаргаффом закономерности, в соответствии с которыми в любой молекуле ДНК: 1) сумма нуклеотидов, содержащих пуриновые азотистые основания, равна сумме пиримидиновых нуклеотидов, т.е. А+Г=Т+Ц; 2) содержание аденина (А) равно содержанию тимина (Т), а содержание гуанина (Г) - содержанию цитозина (Ц), т.е. отношение А к Г и Г к Ц равно 1; 3) количество оснований с кетогруппой в 6-м положении равно количеству оснований с аминогруппой в 6-м положении, т.е. Г+Т=А+Ц, или (Г+Т)/(А+Ц)=1. Эти правила выявили устойчивую взаимосвязь содержания Т и А с одной стороны, и Ц и Г- с другой. Вместе с тем отношение (А+Т)/(Г+Ц), как показано в работах А.Н. Белозерского, А.С. Спирина и других исследователей, видоспецифично и может резко варьировать в ДНК организмов различных видов.

Большую роль в расшифровке строения ДНК сыграло рентгеноструктурное исследование, проведенное (1953) М. Уилкинсом и Р. Франклин. Оно показало, что ДНК - упорядоченная структура, состоящая из повторяющихся элементов, расположенных вдоль оси молекулы на расстоянии 0,34 нм друг от друга. На основании химических данных Чаргаффа и дифракционной картины ДНК, полученной Уилкинсом и Франклин при ее облучении лучами Рентгена, Уотсон и Крик предложили, что ДНК представляет собой молекулу, содержащую две полинуклеотидные цепи. Эти цепи закручены вокруг общей оси в двойную спираль, витки которой, если смотреть вдоль оси спирали, идут по часовой стрелке. Такая конфигурация ДНК называется правозакрученной и обозначается как В-форма. В живой клетке большинство молекул В-ДНК претерпевает дополнительную спирализацию, облегчающую процессы ее репликации и рекомбинации. В результате сверхспирализации в участках В-ДНК, содержащих около 30 повторов ГЦ-пар, появляются районы левозакрученной, или Z-ДНК. Биологическое значение существования ДНК в Z-форме точно не установлено, однако показано, что Z-форма возникает в ходе кроссинговера между хромосомами в пахитене мейоза.

Цепи ДНК образованы последовательностью нуклеотидов, соединенных фосфодиэфирными связями, объединяющими между собой две 2-дезоксирибозы, к каждой из которых присоединено азотистое основание. Спиральная конфигурация молекулы ДНК поддерживается водородными связями между основаниями в противоположных цепях. В результате спаренные основания располагаются между двумя цепями перпендикулярно их оси. Вся эта структура напоминает винтовую лестницу, каркас которой образован сахарофосфатным остовом молекулы, а ступеньками служат спаренные основания.

Существенный элемент модели двойной спирали - принцип комплементарности, заключающийся в том, что спаривание оснований осуществляется строго специфично: аденин всегда связывается с тимином, а цитозин- с гуанином. Комплементарность приводит к тому, что каждая пара оснований содержит по одному пурину и пиримидину. Такая специфичность определяется структурной конфигурацией оснований и их способностью образовывать водородные связи. Движение атомов водорода определяет существование изомеров, или таутомерных форм оснований, способных переходить одна в другую. Специфичность спаривания аденина с тимином и гуанина с цитозином обусловлена тем, что эти основания наиболее часто находятся в ДНК в стабильных амино - и кетоформах, т.е. несут в 6-м положении амино (NH2)- либо кето (СО) группу. Редкие нарушения этого характера спаривания, возникающие в случае перехода оснований в более редкие таутомерные формы - энольную (СОН) и имино (NH), могут привести к возникновению спонтанных мутаций. Комплементарность нуклеотидного состава противоположных цепей молекул ДНК обеспечивает ее способность хранить и передавать генетическую информацию, она же лежит в основе аутокаталитической функции ДНК, т.е. репликации.

Важная особенность структурной организации ДНК - антипараллельное расположение сахарофосфатного каркаса каждой из двух комплементарных цепей. Фосфодиэфирные связи в одной из цепей направлены от атома углерода в 5'-положении в дезоксирибозе одного нуклеотида к атому углерода в 3'-положении другого нуклеотида. В комплементарной цепи эти же связи направлены от 3'- к 5'-углероду. Такая противоположная направленность комплементарных цепей обеспечивает стабильность структуры ДНК. С развитием методов выделения ДНК из различных организмов и ее физико-химического анализа, предложенная Уотсоном и Криком модель была подтверждена экспериментально. Однако предстояло понять, как ДНК самокопируется и кодирует синтез белка.

Репликация ДНК. Полуконсервативный механизм репликации. Для того чтобы объяснить, каким образом может самокопироваться, или редуплицироваться, такая стабильная и замкнутая на себя структура, как двойная спираль ДНК, Уотсон и Крик предположили, что ее цепи способны к раскручиванию и последующему частичному разделению вследствие разрыва водородных связей в каждой комплементарной паре оснований. Образовавшиеся одноцепочечные участки родительской молекулы могут служить матрицей, к которой на основе комплементарности оснований присоединяются соответствующие нуклеотиды. Эти нуклеотиды скрепляются между собой фосфодиэфирными связями с образованием новой цепи, комплементарной родительской. Так как этот процесс происходит на каждой разделившейся цепи исходной молекулы, то в результате образуются две двухцепочечные структуры, идентичные родительской ДНК. Такой способ репликации получил название полуконсервативного, поскольку в каждой из вновь образовавшейся молекул одна цепь является старой (родительской), а другая - вновь синтезированной (дочерней). Этот механизм обеспечивает возможность такого распределения ДНК между делящимися клетками, при котором каждая дочерняя клетка получает гибридную двухцепочечную молекулу ДНК, состоящую из родительской и вновь синтезированной цепи.

Первые данные в пользу гипотезы полуконсервативного механизма синтеза ДНК были получены Дж. Тейлором с соавторами (1957) цитологическим методом при изучении репликации хромосом конских бобов (Vicia faba). Экспериментально эта гипотеза была доказана с помощью физико-химических методов М. Мезельсоном и Ф. Сталем (1958). Сущность их метода заключалась в следующем: бактерии E.coli на протяжении многих генераций выращивали в среде, содержащей в качестве источника азота только его тяжелый изотоп 15N. Эта метка включалась в азотсодержащие пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК, вследствие чего ДНК в клетках, выращенных среде с 15N, имела большую молекулярную массу на единицу объема (т.е. большую плотность), чем ДНК в клетках, выращенных в обычных условиях, в присутствии легкого изотопа 14N. Поэтому, если клетки после длительного выращивания на среде с 15N отмывали и переносили на время, равное одной, двум и т.д. генерациям, в среду с 14N вместо 15N, то это должно было привести к появлению молекул ДНК с меньшей плотностью. Различающиеся по плотности молекулы можно разделить с помощью метода равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности 6М CsCl. Оказалось, что вся ДНК, выделенная из клеток, выращенных в течение одной генерации в среде с 14N, располагается в градиенте CsCl в положении, промежуточном между положением “тяжелой” ДНК из клеток, выращенных только в среде с 15N, и “легкой” ДНК из клеток, выращенных только в среде с 14N. Это значит, что по прошествии одной генерации после переноса из среды с 15N в среду с 14N, в клетках появилась гибридная по плотности ДНК, у которой одна цепь была “тяжелой”, а другая - “легкой”. Если ДНК выделяли из клетки через две генерации после такого переноса, то “гибридная” ДНК составляла лишь половину всей ДНК, распределяющейся в градиенте плотности CsCl, а другая половина располагалась в зоне, соответствующей по плотности молекулам, включавшим только 14N. В следующем поколении эта “легкая” фракция увеличивалась и составляла 75% тотальной ДНК. Такое изменение можно объяснить только с позиций представления о полуконсервативном способе репликации ДНК.

Сделанный Мезельсоном и Сталем вывод был полностью подтвержден и для других объектов, включая животных и высшие растения. Вместе с тем, оставалось неясным, в каком направлении происходит репликация ДНК и какие ферменты обеспечивают этот процесс. Ответ на первый вопрос удалось получить Дж. Кэрнсу (1963) в опытах на E.coli. Он поставил своей задачей сделать процесс репликации ДНК видимым, для чего использовал метод авторадиографии. Этот метод позволяет обнаруживать и локализовывать радиоактивную метку, включающуюся в молекулы ДНК, РНК, либо белка путем их помещения на чувствительную к радиации фотоэмульсию. ДНК можно специфично метить, если выращивать клетки с 3Н-тимидином, являющимся дезоксирибонуклеозидом тимина. Тимидин избирательно включается в ДНК, поэтому выращивание клеток E.coli в среде с меченым по тритию тимидином позволяет следить за распределением метки по мере ее включения во вновь синтезирующуюся ДНК. Поскольку крупные молекулы ДНК легко разрываются при механических повреждениях, Кэрнс разработал такую технику, при которой клетки разрушались ферментом лизоцимом, а ДНК из лизированных клеток собирали на мембранных фильтрах, помещаемых на стекла, покрытые фотоэмульсией, чувствительной к β-частицам, выделяющимся при распаде трития. Радиоавтографы, полученные после проявления таких фотографических стекол, выдерживавшихся предварительно в темноте до образования зерен металлического серебра, показали, что хромосома E.coli имеет кольцевидную форму и во время своей репликации образует структуры в форме греческой буквы Ɵ. Обнаружение подобных структур, являющихся формами молекул ДНК в процессе их репликации, показывало, что раскручивание двух комплементарных цепей родительской ДНК и их полуконсервативная репликация происходят практически одновременно и начинаются в общей точке начала репликации, обозначаемой как локус ori (от англ. origin- начало). Последующий анализ результатов опыта Кэрнса и данные других экспериментаторов, нацеленных на изучение механизма репликации ДНК у различных бактерий, фагов, плазмид, показали, что в большинстве случаев она происходит двунаправлено и начинается, как правило, от одного уникального локуса ori. В этом месте в одной из цепей ДНК разрывается фосфодиэфирная связь, обеспечивающая последующее раскручивание дуплекса и образование особых структур - репликативных вилок, движущихся в противоположных направлениях по кольцевой ДНК. Следует, однако, отметить, что в ДНК эукариот, как правило, обнаруживается не один, а множество локусов ori, что, по-видимому, служит необходимым условием для того, чтобы громадные молекулы ДНК в хромосомах эукариот успели полностью отреплицироваться за время одного клеточного цикла.

Эксперименты, проведенные на прокариотах (E.coli, T7, некоторые плазмиды), также выявили в их ДНК (скорость репликации которых составляет около 20 мкм/мин, что в 20-30 раз выше, чем у эукариот) не по одному, а по два или даже более локусов ori. Среди этих локусов наблюдается подчиненность: когда активен главный ori, остальные могут не функционировать, и, напротив, в случае выключения главного ori запасные ori обеспечивают репликацию ДНК. Очевидно, такая зависимость обеспечивает стабильность важнейшей функции ДНК - ее способности к репликации.

Ферменты репликации. Как уже отмечалось, принцип комплементарности, заложенный в структуре двойной спирали ДНК, определяет возможность самокопирования генетического материала. Как и большинство других биологических процессов, репликация ДНК обеспечивается координированной работой ряда ферментов. Важнейшие из них: ДНК-топоизомеразы, обеспечивающие локальное расплетание ДНК, необходимое для инициации ее репликации и образование одиночных цепей, служащих матрицами для вновь синтезируемых дочерних молекул. Расплетенная замкнутая кольцевая молекула под действием фермента ДНК-гиразы образует сверхскрученную форму с большим запасом свободной энергии, расходуемой затем в ходе репликации; ДНК-полимеразы, катализирующие добавление нуклеотидов к 3'ОН концу цепи ДНК; ДНК-лигазы, сшивающие сахарофосфатный конец молекулы.

Изучение ферментологии репликации ДНК было начато А. Корнбергом (1957), выделившим из E.coli ДНК-полимеразу I. Этот крупный фермент с Мr 109 000 способен осуществлять синтез ДНК in vitro, катализируя ковалентное присоединение к предсуществующей цепи ДНК 5'-нуклеотидов, предшественниками которых служат содержащиеся в клетках трифосфаты дезоксиаденозина (дАТФ), дезокситимидина (ТТФ), дезоксигуанозина (дГТФ) и дезоксицитидина (дЦТФ). ДНК-полимераза не способна начать синтез цепей ДНК de novo, поэтому для проявления ее полимеризующей активности необходимо, чтобы в системе присутствовала так называемая ДНК-затравка, т.е. цепь ДНК, имеющая свободный 3'ОН конец. ДНК-полимераза I обеспечивает образование фосфодиэфирной связи между 3'ОН концом ДНК-затравки и 5'-фосфатом присоединяемого дезоксирибонуклеотида с одновременным освобождением пирофосфата, т.е. двух остатков фосфорной кислоты. В результате ДНК-затравка удлиняется в направлении от своего 5'-фосфатного конца к 3'-гидроксильному. Присутствие в этой системе еще одной одноцепочечной ДНК, так называемой ДНК-матрицы, определяет, какие именно дезоксирибонуклеотиды должны присоединяться к ДНК-затравке. Таким образом, в присутствии ДНК-затравки и ДНК-матрицы ДНК-полимераза I обеспечивает синтез дочерней цепи ДНК, комплементарной одной из цепей родительской ДНК, что, является необходимым элементом полуконсервативной репликации. Вместе с тем ДНК-полимераза I - многофункциональный фермент. Помимо 5'-3'-полимеразной активности она обладает еще 3'-5'-экзонуклеазной активностью, катализирующей отщепление нуклеотидов с 3'-конца синтезирующейся полинуклеотидной цепи. Эта активность получила название “корректорной”, поскольку направлена на коррекцию (исправление), хотя и очень редких ошибок полимеразной активности, в результате которых в растущую цепь подстраивается ошибочный нуклеотид, не комплементарный противоположному нуклеотиду ДНК-матрицы. “Корректорная” активность ДНК-полимеразы I обеспечивает точность репликации ДНК и тем самым снижает частоту мутаций, связанных с ее ошибками. Обе активности располагаются в одном активном центре молекулы ДНК-полимеразы I, что как бы создает возможность “слежения” 3'-5'-экзонуклеазной за точностью работы 5'-3'-полимеразной. Наряду с этим ДНК-полимераза I имеет еще один активный центр, в котором находится 5'-3'-экзонуклеазная активность, участвующая, возможно, в репарации повреждений ДНК.

Более поздние исследования показали, что ДНК-полимераза I играет в вегетативной репликации хромосом у E.coli не основную, а лишь вспомогательную роль. Изучение мутантов E.coli, дефектных по полимеразной активности этого фермента, выявило их способность к репликации ДНК. Однако такие мутанты оказались высокочувствительными к летальному действию УФ-излучения, что указывало на их неспособность к репарации поврежденной ДНК. Отсюда был сделан вывод, что ДНК-полимераза I обеспечивает in vivo не вегетативный, а репаративный синтез ДНК, направленный на восстановление ее нормальной структуры после вырезания поврежденных физическими или химическими воздействиями участков. Вместе с тем в клетках E.coli были обнаружены еще две ДНК-полимеразы (II и III), одна из которых, ДНК-полимераза III (Мr свыше 250 000), играет основную роль в вегетативной репликации ДНК.

Большинству обнаруженных у прокариот ДНК-полимераз присущи две из трех рассмотренных функций ДНК-полимеразы I: способность катализировать рост цепей ДНК в 5'-3'-направлении путем подстановки 5'-нуклеотидов, комплементарных ДНК-матрице, и коррекция возможных ошибок в ходе этого процесса с помощью 3'-5'-экзонуклеазной активности. У различных эукариот в настоящее время выявлены, по крайней мере, три ДНК-полимеразы: α, β, γ. Предполагается, что первая играет основную роль в репликации ядерной ДНК, а вторая - в ее репаративном синтезе. Роль третьей до конца не выяснена.

Этапы репликации. Рассмотрим механизм осуществления основных этапов репликации ДНК - инициации и элонгации. Инициация репликации происходит в локусе ori и начинается с появления Y-образной структуры - репликативной вилки, образование которой связано с раскручиванием дуплекса ДНК и локальным разделением ее цепей. Продвижению репликативной вилки вдоль каждой из цепей ДНК предшествуют стабилизация ее расплетенной сверхскрученной структуры ферментом SSB (от англ. single strand binding), специфично связывающимся с однонитевой ДНК, и появление затравочного полинуклеотида, к 3'ОН-концу которого начинают присоединяться последующие нуклеотиды. Для ДНК полимеразы I в системе in vitro такой затравкой служит предшествующая цепь ДНК. Однако in vivo во всех исследованных случаях подобной затравкой служит не ДНК, а сравнительно короткая РНК, синтез которой осуществляется РНК-полимеразой, либо особым ферментом “праймазой”. Образующиеся на коротком участке между ДНК матрицей и РНК затравкой гибриды обеспечивают, как показано у E.coli, возможность следующего за инициацией этапа синтеза ДНК - элонгации ее цепей в направлении 5'-3', осуществляемой от 3'ОН-конца РНК затравки ДНК-полимеразой III. Немного позднее ставшая ненужной РНК-затравка удаляется, и в освободившийся участок встраиваются нуклеотиды, комплементарные ДНК-матрице. Ковалентное сшивание этой ДНК, синтезированное вместо РНК-затравки, с основной, вновь образованной цепью ДНК, осуществляет ДНК-лигаза, катализирующая образование фосфодиэфирных связей между соседними 3'ОН и 5'-Ф-концами.

Поскольку две цепи дуплекса ДНК антипараллельны, синтез комплементарных им нитей должен в одном случае идти в направлении 5'-3', а в другом - в направлении 3'-5'. Первая нить называется лидирующей, вторая- запаздывающей. Как отмечалось, все известные ДНК-полимеразы нуждаются для своей активности в свободном 3'ОН-конце, к которому они присоединяют нуклеотиды. В результате происходит рост цепи ДНК в направлении 5'-3'. Как же в таком случае осуществляется синтез цепи ДНК в направлении 3'-5'? Предполагалось, что для этого необходима какая-то особая ДНК-полимераза. Оказалось, однако, что синтез 3'-5'-цепей носит прерывистый характер. Он осуществляется комплексом ферментов, называемым праймосомой, в состав которого входит обычная ДНК-полимераза, синтезирующая сравнительно короткие (длиной 100-200 нуклеотидов у эукариот и 1000-2000 нуклеотидов у E.coli) фрагменты ДНК в направлении 5'-3'. Синтез каждого такого фрагмента инициируется РНК-затравкой длиной около 10 нуклеотидов. После удаления РНК-затравки и завершения синтеза ДНК на освободившихся участках, эти фрагменты, названные по имени открывшего их японского ученого Оказаки, объединяется между собой ДНК-лигазой. Такой, казалось бы, вынужденный способ синтеза ДНК у некоторых организмов осуществляется на обеих цепях, т.е и тогда, когда в принципе в нем нет необходимости.

Помимо рассмотренного известен еще один тип репликации ДНК - по способу “катящегося кольца”; так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в одной из цепей исходной ДНК (“+”- цепь) происходит разрыв и освободившийся 5'-конец присоединяется к клеточной мембране. На 3'-конце “+”-цепи по комплементарной матрице не разорванной “-”-цепи начинается прерывистый синтез дочерней цепи. При этом происходит вращение кольцевой “-”-цепи родительской молекулы, обеспечивающее “сползание” с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК. Осуществляется он и в случае переноса плазмидной или хромосомной ДНК от донора к реципиенту в процессе конъюгации у бактерий.

Репликация ДНК тесно связана с клеточным делением и играет для него роль биологических часов. У бактерий подавление репликации до ее окончания блокирует возможность их деления. Врастание клеточной мембраны обеспечивает сегрегацию (расхождение) вновь синтезированных молекул между дочерними клетками.

Вопросы к 1 занятию:

1) Назовите основные этапы в истории изучения нуклеиновых кислот. В каких экспериментах была доказана роль ДНК в хранении и передаче наследственной информации?

2) Опишите строение нуклеотидов; какие химические связи формируют и стабилизируют молекулы нуклеиновых кислот. Сформулируйте правила Чаргаффа. Опишите модель ДНК, предложенную Уотсоном и Криком. Какие существуют формы спирали ДНК?

3) Опишите три модели репликации ДНК? Каким способом происходит удвоение ДНК в живой клетке? Опишите эксперименты Мезельсона и Сталя по доказательству полуконсервативного способа репликации ДНК.

4) Дайте общую характеристику процесса репликации ДНК. Каковы основные различия в репликации ДНК у про- и эукариот? Перечислите ферменты репликации ДНК и их функции.

5) Изобразите схематично отдельные этапы репликации ДНК: инициация, элонгация, терминация. Определите термины: репликативная вилка, репликативный глазок, репликон, точка ori, праймеры, отстающая цепь, лидирующая цепь, фрагменты Оказаки.

 



Поделиться:




Поиск по сайту

©2015-2024 poisk-ru.ru
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2021-02-02 Нарушение авторских прав и Нарушение персональных данных


Поиск по сайту: