1. С выросшего монослоя в пробирках сливают ростовую питательную среду, клеточный слой ополаскивают раствором Хенкса для удаления белка питательной среды и продуктов клеточного обмена. Затем в КК наливают 0,8мл вируса или рабочей суспензии.
4-6 пробирок с КК оставляют для контроля, где только заменяют питательную среду.
С.°Зараженные и контрольные пробирки с КК помещают в термостат при температуре +37
и ставят в термостат на инкубацию.°2. Сливают ростовую питательную среду. На клеточный слой наносят исследуемый материал или вирус. Плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают 1-2 часа на контакте. За это время вирус адсорбируется на поверхности клеток и частично проникает внутрь клеток. Затем монослой промывают раствором Хенкса, сливают жидкость вместе с продуктами клеточного обмена и не адсорбированным вирусом. В каждую пробирку наливают по 1мл поддерживающей питательной среды, плотно закрывают пробками, укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6
Ежедневно проводят микроскопию КК на выявление ЦПД. Микроскопию всегда начинают с контрольных КК.
Наиболее широко применяют стационарное инкубирование в термостате при 37 °С. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки - под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе - роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.
Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому (цитопатогенному) эффекту или цитопатическому (цитопатогенному) действию.
Американский ученый Хуанг в 1945 году объединил все дегенеративные изменения в пораженной вирусом клетке под общим названием ЦПД или ЦПЭ (цитоплазменное действие вируса или цитоплазменный эффект).
ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса.
ЦПД - это морфологические и функциональные изменения в культуре клеток под действием вируса, т.е. дегенерация, перерождение разрушение и гибель клетки.
Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8-10, окуляр х7-10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4 - на три, если2¤1 - ¤на два креста, 14 - на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.
С) инактвирует значительную часть освободившегося вируса в культуральной жидкость. Выраженные поражения 50% клеток монослоя свидетельствуют об активной репродукции вируса во всех клетках. Зараженные пробирки или матрацы энергично встряхивают, клетки разрушаются, вирус заходит в питательную среду, которая называется культуральная жидкость.°Нельзя допускать дегенерации всех клеток монослоя, т.к температура термостата (+37
Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 сут. после заражения (энтеровирусы), другие - через 1-2 нед. (аденовирусы).
Ряд авторов пытались сгруппировать сходные формы ЦПД. У одних получилось 23 формы, у других - 11, У третьих - 5 и т.д. Но наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.
Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).
Округление - потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).
Симпластообразование - растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цитоплазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот метод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы свиней некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.) Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.
Таким образом, ЦПД - это погибающие или погибшие клетки под действием вируса. Такие же дегенеративные процессы под действием вируса проходят и в клетках больных животных и людей.
Классификация ЦПД по Эндерсу включает 3 типа дегенерации в клетках.
1-й тип-набухание и округление инфицированных клеток с последующим появлением в них их цитоплазме выраженной зернистости, за счет фрагментации ядра и скопления продуктов нарушенного клеточного обмена. Затем эти клетки разрушаются.
2-й- образование цитоплазматических и внутриядерных включений с последующим разрушением клеток.
3-й- характеризуется образованием гиганских многоядерных клеток симпластов, за счет слияния нескольких разрушенных клеток с цитоплазматическими и внутриядерными включениями.
Один вирус может вызвать дегенерацию клеток по 1 типу, другой по 2 типу и т.д. Эти изменения настолько характерны, что становится возможным не только определить наличие вируса в клетке, но и до некоторой степени судить о принадлежности вируса к тому или другому семейству.
Профессор Анджепаридзе внес существенные дополнения в оценку ЦПД, уточнил и детализировал этапы дегенеративных изменений в пораженных вирусом клетках.
1.Набухание и округление клеток.
2.Появление в цитоплазме мелкой зернистости.
3.Появление в цитоплазме крупной зернистости.
4.Выпадение пораженных клеток из монослоя.
5.Фрагментация ядра.
6.Распад клеток образованием гиганских многоядерных клеток за счет слияния отдельных разрушенных клеток.
7.Отсутствие видимых дегенеративных изменений в клетках(латентная вирусная инфекция).
При неопластической трансформации пораженных клеток в монослое образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).
Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к «слепым» пассажам. Необходимо провести не менее трех «слепых» пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.
31 Серологическая диагностика вирусных болезней. Сущность, виды и назначение серологических реакций. Для диагностики вирусных болезней в ветеринарной практике применяются различные серологические реакции: РСК, РЗГА, РН (реакция нейтрализации вируса), РДП (реакция диффузной преципитации) и другие. В основе их лежит способность антител, находящихся в сыворотке крови, реагировать со специфическими антигенами вирусов. Следовательно, для постановки любой серологической реакции обязательными компонентами являются антиген и антитело. Антитела образуются в организме животных клетками лимфоидной ткани (В-лимфоцитами) на введение (при иммунизации) или попадание (при заражении) какого-либо антигена и накапливаются, как в депо, в сыворотке крови. Антитела выполняют защитную роль, как фактор специфической защиты организма. По химической природе антитела являются белками, специфическими иммунными глобулинами (иммуноглобулины пяти классов) и содержатся преимущественно в гамма-глобулиновой фракции крови. В зависимости от вида серологических реакций антитела, участвующие в них, называют по-разному: в РСК - комплементсвязывающие; в РДП - преципитирующие (преципитины); в РН - вируснейтрализующие антитела; в РЗГА - антигемагглютицины и т.д. Такое разнообразие антител объясняется различием антигенной структуры вирусов. В составе вирусов содержатся различные антигены, которые стимулируют выработку различных по действию антител. Антигены - это вещества белковой природы, которые при попадании (или введении) в организм парэнтеральным путем (т. е. минуя желудочно-кишечный тракт) вызывают образование антител. С образовавшимися антителами антигены могут вступать в реакцию (специфическое взаимодействие) как в организме животного, так и вне организма (ин витро, в пробирке), что и используется при постановке реакций. В результате такого взаимодействия происходит обезвреживание свойств антигена (вируса). Так, обезвреживание инфекционных свойств антигена (вируса) мы устанавливаем в реакции нейтрализации вируса, гемагглютинирующие свойства - в реакции задержки (торможения) гемагглютинации и т. д. Вирусы содержат различные белки, отличающиеся друг от друга не только по строению, физико-биохимическим свойствам, но и по антигенности. По белковому составу, а, следовательно, и по антигенности вирусы не одинаковы, что и используется при их серологической дифференциации и идентификации. Так, вирус гриппа имеет 5 разных антигенов: нейраминидазу, гемагглютинин, S-антиген и два малоизученных антигена. Вирус ящура содержит ^антигена, вирус чумы КРС имеет преципитирующий и комплементсвязывающий антигены. В зависимости от применяемых серологических реакций антигены, участвующие в них, называются, так же, как и антитела, по-разному: в РСК - комплементсвязывающий антиген, в РН - антиген, вызывающий образование вируснейтрализующих антител, в РДП - преципитирующий антиген (преципитиноген), в РЗГА и РГА - гемагглютинирующий антиген (гемагглютинин) и т.д. Антигены у различных групп вирусов строго специфичны и могут реагировать только с соответствующими антителами. У вирусов, входящих в одну группу, некоторые антигены могут быть общими для всей группы (группоспецифические), другие антигены являются специфичными только для одного какого-либо штамма данной группы (штам- мо-специфические). При постановке серологических реакций выявление антител или антигена основано на принципе специфичности их взаимодействия, т. е. антигены взаимодействуют только со специфическими антителами и наоборот. Поэтому в серологических реакциях один из этих компонентов (антиген-вирус, или антитело) должен быть заранее известным и по нему определяют второй (неизвестный в реакции) компонент. В связи с этим серологические реакции могут быть поставлены в двух вариантах: а) с известными иммунными или гипериммунными сыворотками (диагностические сыворотки) для определения (идентификации и типизации) вирусов, выделенных из исследуемого патологического материала; б) с известными антигенами (диагностикумами) для обнаружения антител и определения их количества в присылаемых для исследования сыворотках крови, взятых от больных и переболевших животных. С помощью серологических реакций можно установить сроки появления в крови антител у вакцинированных животных и выявить динамику антителообразования. В качестве антигенов при постановке серологических реакций применяют: а) надосадочную жидкость из суспензий органов, содержащих вирусы, после многократных замораживаний и размораживаний с последующим центрифугированием; б) культуральную жидкость из зараженных культур тканей; в) материал (суспензия оболочек или куриного эмбриона, жидкости из полостей) из зараженных куриных эмбрионов; г) содержимое афт, пустул, истечения и смывы из носа и других полостей, жидкости из полостей организма и т. д. Антигеном может быть живой (нативный) вирус или обезвреженный (инактивированный, убитый) вирус. Иногда для повышения качества и специфичности серологических реакций предварительно проводят очистку и концентрацию антигена (вируса).
32 Сущность, техника постановки и учет реакции гемагглютинации (РГА). РГА не относится к серологическим реакциям, так как в ней не участвует иммунная сыворотка, т. е. антитела. В основе РГА лежит агглютинация, т. е. склеивание эритроцитов человека, животных и птиц под действием вируса. Впервые РГА была описана в 1941 году Херстом, который показал, что эритроциты цыплят способны агглютинироваться под воздействием аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа. Позже было установлено, что способность вызывать агглютинацию эритроцитов обладают не только вирусы гриппа, но и некоторые другие представители миксовирусов (вирусы парагриппа, паротита, болезни Ньюкасла и др.), аденовирусы, вирусы оспы, некоторые нейротроп- ные вирусы и другие. РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемагглютинирующих единиц - АЕ). С помощью РГА нельзя иипировать и идентифицировать вирусы, т. к. в ней не участвует сыворотка (антитело). Гемагглютинацией обладают не все вирусы. Миксовирусы агглютинируют эритроциты многих видов животных, кур и человека. При постановке РГА нужно знать, какие эритроциты данным вирусом агглютинируются.Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок. Механизм РГА заключается в следующем: на поверхности эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, способные адсорбировать до 10.000 вирионов, а на поверхности гемагглютинирующих вирусов располагаются гемагглютинины - сложные белковые тела с энзиматической активностью. При смешивании эритроцитов с вируссодержащей жидкостью гемагглютинины вируса при помощи фермента муциназы вступают во взаимодействие с рецепторами эритроцитов, в результате чего происходит адсорбция вирусов на эритроцитах. Ви- рионы, адсорбированные на одном эритроците, способны свободными поверхностями соединяться с другими эритроцитами, образуя при этом мостики между ними, ч го и приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов.Адсорбция вирусов на эритроцитах является энзиматическим процессом. Через некоторое время после проявления гемагглютинации связь между вирусами и эритроцитами нарушается, так как вирусная муциназа разрушает рецепторы эритроцитов и вирусы элюируют (отсоединяются) с эритроцитов. Это надо иметь в виду при учете реакции. После элюции вируса эритроциты оседают на дно пробирки в виде бугорка (холмика, пуговки). Использованные в РГА эритроциты вторично этим же вирусом не агглютинируются, т. к. чувствительные к данному вирусу рецепторы у эритроцитов уже разрушены, но могут быть агглютинированы другими вирусами, к которым сохранились рецепторы. В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, смывы, материал из зараженных куриных эмбрионов, культур ткани и др.), в котором предполагается наличие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек. Эритроциты применяют в виде 1% взвеси в физиологическом растворе. Они могут быть свежеприготовленные или консервированные. Физиологический раствор для постановки реакции используют с рН 7,0 - 7,4. Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю вируссодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой. В положительных случаях через несколько минут произойдет агглютинация эритроцитов в виде образования хлопьев. При постановке реакции пробирочным способом используют серологические пробирки или панели (пластины из стекла или оргстекла) с лунками. В этом случае предварительно готовят двукратные разведения вируссодержащего материала, начиная с 1:10 (и далее двукратные разведения: 1:20, 1:40, 1:80 и т.д.) и до 1:1280 (иногда и более высокие). К каждому из разведений вируссодержащего материала, взятых в объеме по 0,5 мл, затем добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов и пробирки после встряхивания оставляют в покое на 30-60 минут при комнатной температуре, а затем учитывают результаты. Оценивают реакцию в крестах (плюсах). При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осадка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробирки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста (++++). При оседании эритроцитов в виде зонтика, но с наличием менее равномерного распределения его по дну - три креста (+++). Если эритроциты осели в виде зонтика, но с волнистыми краями и в центре дна имеется более толстый слой из осадка неагглютинированных эритроцитов, реакцию считают в два креста (++). Значительное оседание эритроцитов плотным диском в центре пробиркой с зернистой каймой по краям (при наклоне пробирки эритроциты сползают) оцениваются в один крест (+). Если же эритроциты оседают на дно пробирки в виде холмика (бугорка) с ровными краями, при наклоне пробирки сползают такую реакцию считают отрицательной (-). Титром вируса считается то наибольшее разведение его, которое способно давать реакцию гемагглютинации не менее чем в два (++) креста. Такое разведение содержит одну гемагглютинирующую единицу (1 АЕ).
33 Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) Широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов. Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело.
Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного. Выбор эритроцитов зависит от вируса, используемого в РТГА. Так, для вирусов гриппа используют эритроциты кур, для ПГ-3 КРС — эритроциты морской свинки. Обычно используют 0,5—1%-ную взвесь эритроцитов.
Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса.
РТГА можно ставить в двух вариантах:
1. к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ);
2. к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы сыворотки.
Сыворотки, используемые в РТГА, должны быть предварительно освобождены от термолабильных и термостабильных ингибиторов.
Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим этапам:
o титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр;
o приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);
o ставят главный опыт РТГА;
o учитывают результаты.
Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию.
РТГА ставят в пробирках, специальных полистироловых планшетах макро- или микрометодом.
РТГА позволяет решить следующие диагностические задачи:
o обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью известного вируса;
o идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами).
Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов.
34 Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител). Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк — реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:
· фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
· обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
· сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:
· к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
· смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С;
· учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.
РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.
РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:
· обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
· обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).
35 Реакция связывания комплемента (РСК) Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных этапов. На первом этапе участвуют антиген и антитело (один из этих ингредиентов заранее известен), а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии антигена и антитела их комплекс связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним — гемолизина). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антитела, то лизиса эритроцитов не происходит (положительная РСК). При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов. РСК часто используют в диагностической практике для обнаружения и идентификации вирусов, обнаружения и титрования антител в сыворотках крови.
Основными компонентами РСК служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент (сыворотка крови морской свинки), гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2—7,4) или различные буферные растворы.