Можно выделить шесть основных целей или направлений, в которых широко используются живые системы.
1. Индикация вируса – обнаружение вируса
2. Изоляция вируса – выделение вируса
3. Идентификация вируса – установление вида вируса
4. Поддержание вируса – сохранение репродуктивной способности вирионов вирусов
5. Титрование вируса – определение инфекционной активности вируса
6. Накопление вируса – получение «урожая» вируса для его дальнейшего использования; например, для создания вакцин первого и второго поколения и для получения антигенов вируса
А если говорить о лабораторных животных, то помимо вышеперечисленных, можно добавить еще две цели:
1. Постановка биопробы для получения специфической клинической картины вирусной болезни. Например:
- биопроба на морской свинке, если поставлен предварительный диагноз - ящур;
- биопроба на кролике, если поставлен предварительный диагноз - болезнь Ауэски;
- биопроба на цыпленке, если поставлен предварительный диагноз - оспа кур.
Данные вирусы вызывают у этих «живых систем» настолько специфические клинические симптомы болезни, что являются достаточно убедительными и достоверными для окончательного подтверждения диагноза на вирусную болезнь.
2. Получение специфической сыворотки (гипериммунной) против определенного вида вируса. В дальнейшем такую сыворотку можно использовать для млекопитающих как средство специфической профилактики и лечения вирусной инфекции, а также при лабораторных исследованиях различных видов патологического материала в диагностике вирусной болезни.
Индикация вируса в живой системе. Для индикации (обнаружение) какого-то вируса в тестируемом патологическом (диагностическая работа) или изучаемом материале (научно-исследовательская работа) можно использовать одну или несколько лабораторных живых систем. При ее выборе главным требованием будет являться наибольшая чувствительность к определенному виду вируса.
После этого заранее подготовленный к биопробе вируссодержащий материал, прошедший контроль на отсутствие посторонних контаминантов, инокулируют в чувствительную живую систему. Обязательно в таком эксперименте должны быть и не зараженные, т.е. контрольные живые системы.
После этого зараженные и контрольные живые системы помещают в аналогичные условия и проводят наблюдения за ними, т.е. определяют признаки репродукции вируса. Таблица 2
| Вид живой системы | Условия содержания | Признаки репродукции | Вторичный пат. мат.-л |
| Лабораторные животные | 1 Виварий; 2 Контрольные и зараженные живо- тные содержатся в разных отсеках | 1 Продолжительность инкубационного периода; 2 Клинические симптомы 3 Гибель | 1 Кровь; 2 Уч-ки пора- женной кожи; 3 Ткань, поражен- ных органов |
| Куриные эмбрионы | Термостат: 37°С, влажность 60-70% | 1 Гибель; 2 Патологоанатомические изменения в структурах; 3Реакция гемагглютинации (для гемагглютинирую- щих вирусов) | 1Ткань поражен- ных оболочек; 2 Ткань поражен- ного зародыша; 3 Аллантоисная жидкость |
| Культура клеток | Термостат: 37°С | 1Цитопатическое действие 2. Реакция гемадсорбции (для геадсорбирующих вирусов) | Культуральная суспензия клеток |
Если после инокуляции вируса признаки репродукции в живой системе отсутствуют, то это называется слепой пассаж. При таком результате пассажа (биопробы) рекомендуется, исходя из патогенеза болезни, вызываемой данным вирусом, собрать пробы от живой системы, приготовить суспензию и инокулировать в аналогичную живую систему.
Таких повторяющихся пассажей проводят не менее трех, последовательно отбирая пробы от каждой предыдущей живой системы.
Изоляция вируса в живой системе. В случае положительного результата биопробы, т.е. при обнаружении признаков репродукции вируса в живой системе, проводят его изоляцию или другими словами вирусовыделение. Для этого отбирают пробы от живой системы (см. табл.2), которые в дальнейшем называются - вторичный патологический материал.
Признаки репродукции вируса, получаемые в результате биопробы в живой системе, могут не отличаться или быть очень похожими у вирусов, которые относятся к разным видам. Это объясняется одинаковым тропизмом вирусов и схожей стратегией их репродукции в идентичных клетках-мишенях. Поэтому для их идентификации, т.е. установления вида вируса, требуются дополнительные методы исследования. В некоторых их них также используют живую систему.
Идентификация вируса в живой системе. Существует несколько методов идентификации вируса, где используют, живую систему. Примером являются такие серологические реакции, как реакция нейтрализации (РН), иммунной флуоресценции (РИФ), а в последнее время и твёрдофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
В основе РН лежит взаимодействие антигенов активного вируса с антителами сыворотки крови и в случаи их специфичного взаимодействия образуется комплекс антиген-антитело, а вирус утрачивает свою инфекционную активность. Чтобы доказать это, ставят биопробу на чувствительной живой системе, и при положительном результате РН биопроба оказывается отрицательной, другими словами – признаки репродукции идентифицируемого вируса отсутствуют.
РИФ с использованием, например, культуры клеток, выполняют для идентификации так называемых не цитопатогенных вирусов. Это вирусы, которые при репродукции в культуре клеток вызывают не литическую инфекцию без выраженных патоморфологических признаков. Примером является вирус классической чумы свиней, некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.
КК выращивают на специальных стеклах и заражают вирусом. После определенной экспозиции на подготовленное стекло наносят специфический флуоресцирующий коньюгат. Положительным результатом реакции считают характерное свечение под люминесцентным микроскопом.
Идентификацию вирусов в зараженной культуре клеток проводят и методом прямого варианта ИФА (ELISA). Для этого в лунках полистироловых планшет выращивают культуру клеток, заражают вирусом и после экспозиции добавляют сначала специфический ферментативный коньюгат, а после инкубации с ним вносят субстратно - хромогенную смесь. Обнаружение характерного окрашивания позволяет идентифицировать вирус.
Поддержание и накопление вируса. Живые системы могут использоваться для поддержания и клонирования вирусов. В вирусологических лабораториях научных центов, а также на предприятиях по производству противовирусных препаратов вирусы сохраняют на длительное время. Для этого их консервируют методом замораживания или лиофильного высушивания. При очень длительном сроке консервации у вирусов может снижаться инфекционная активность и в этом случае требуется ее восстановить, другими словами «поддержать» вирус. Это можно сделать методом культивирования вируса в чувствительной живой системе и получить клон вируса с более высокой репродуктивной активностью.
С целью накопления вируса, чтобы в дальнейшем полученный «урожай» использовать для производства либо живой культуральной вирус - вакцины, либо антигена для инактивированной или компонентной вакцины используют в основном культуру клеток и куриные эмбрионы. Кроме того, из накопленного и инактивированного вируса выделяют отдельные белки, которые в дальнейшем используют в виде специфических антигенов для диагностических тест - наборов.
Титрование вирусов. Количественную оценку вируссодержащего материала проводят методом титрования в чувствительной живой системе. С этой целью из титруемого материала готовят последовательные 10-ти кратные разведения вируса и заражают живые системы. При этом на каждое разведение вируса приходится группа их живых систем, одинаковых по виду и количеству (чётное количество, но не менее четырех тест-объектов), которым вводят равное количество вирусной суспензии.
Результат заражения (биопробы) оценивают по признакам репродукции вируса, который иначе называется эффект действия вируса в живой системе, а количественный показатель инфекционной активности вируса – инфекционный титр вируса выражают в эффективных 50-ти процентных единицах действия – ЭД50/мл.
При титровании вируса на лабораторных животных:
- за эффект действия вируса могут принимать либо гибель животного, либо клинические симптомы, вызываемой вирусной болезнью, и титр вируса в таком случае будут выражать соответственно в летальных (ЛД50/мл) или инфекционных дозах (ИД50/мл);
При титровании вируса на куриных эмбрионах:
- за эффект действия вируса могут принимать либо их гибель, либо определенный вид патологических изменений, либо образование оспин на ХАО, и титр вируса в таком случае будут выражать соответственно в эмбриональных летальных (ЭЛД50/мл) или эмбриональных инфекционных дозах (ЭИД50/мл), или оспообразующих единицах (ООЕ);
При титровании вируса на культуре клеток:
- за эффект действия вируса могут принимать его цитотоксическое действие (цитотоксический эффект) или образование очагов лизированных клеток под слоем агара с красителем - бляшки, и титр вируса в таком случае будут выражать в цитотоксических единицах действия (ЦТД50/мл, ЦТЭ50/мл) или бляшкообразующих единицах (БОЕ).