Синтез глутамата натрия осуществляется из глутаминовой кислоты, произведенной бактериями Coryn. Glutamicum.
Поскольку биосинтез глутаминовой кислоты предполагает высокую активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, производственное культивирование должно проводится при интенсивной аэрации.
Воздух, подаваемый в ферментатор, выполняет несколько функций:
1) снабжает микроорганизмы кислородом
2) отводит газообразные продукты обмена
3) отводит теплоту, выделяемую микроорганизмами
4) создает однородность суспензии массы микроорганизмов
5) увеличивает скорость массопередачи и перемешивания жидкой среды.
На первом этапе происходит очистка атмосферного воздуха от пыли и его сжатие.
Атмосферный воздух поступает через фильтр предварительной очистки 1 в компрессор 2, где сжимается до необходимого давления (350-500кПа).
На втором этапе сжатый воздух необходимо поддерживать в оптимальном термодинамическом состоянии. При сжатии воздух нагревается до 100-200 градусов, поэтому его охлаждают в теплообменнике 3 до 25-30 градусов. При охлаждении сжатого воздуха конденсируется имеющаяся в атмосферном воздухе влага, которую отделяют во влагоотделителе 4. После отделения воды воздух нагревают до температуры культивирования микроорганизмов в теплообменнике-нагревателе 5. Далее воздух поступает в головной фильтр 6, где поддерживается его оптимальная температура и влажность. В этом фильтре происходит также и холодная стерилизация воздуха, так как вместе с частицами пыли отделяются и клетки микроорганизмов.
На третьем этапе осуществляется окончательная стерилизация воздуха в индивидуальном фильтре тонкой очистки.
Рис. 6: Технологическая схема приготовления посевного материала: 1-выращивания посевного материала в заводской лаборатории; 2-выращивание в инокуляторах объемом 2м3; 3- выращивание в инокуляторах объемом 5м3; 4- выращивание в биореакторах объемом 50м3.
Первая стадия (рис.6) выращивания посевного материала осуществляется в заводской лаборатории. Исходную культуру размножают на скошенной агаризованной среде в пробирке в стерильных условиях при оптимальных составе питательной среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность).
Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агаризованной среды в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Для промышленных штаммов С. glutamicum питательные среды содержат следующие компоненты (в %):
Меласса 8
Кукурузный экстракт 0,3
Хлорид аммония 0,5
Калия фосфат двухзамещенный 0,05
Сульфат магния 0,03
Вода остальное
рН среды 7,0-7,2
Колбы с культурой помещают на качалку, которая находится в термостатируемом помещении. Продолжительность выращивания культуры в колбах на качалке составляет 24 ч. Эта стадия выращивания контролируется по морфологическим показателям микроорганизма. Наилучшие показатели дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста.
На второй стадии выращивания посевного материала (рис.6) готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор) объемом 2м3. Происходит накопление биомассы до 6-8 г АСВ на 1 л среды в аэробных условиях. Состав питательной среды такой же как и при выращивании в колбах Эрленмейера, но с добавление 0,1% стерильного синтетического пеногасителя. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2.
Третья стадия (рис.6) культивирования посевного материала повторяет вторую стадию, но процесс уже осуществляется в инокуляторах объемом 5м3. Для этого все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится пострерилизованная питательная среда того же состава, что и использовалась на предыдущей стадии. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2. По завершении процесса ферментации в посевных аппаратах культура не должна содержать фагов, посторонней микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл. Полученный посевной материал в количестве 5-6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы.
Посевные аппараты на второй и третьей стадии оснащены мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, рН, уровня пены и т.д. Количество посевного материала, передаваемое в инокуляты, может варьировать в широких пределах от 1 до 20% по объему. Коэффициент заполнения посевного аппарата в зависимости от конструкции его отдельных узлов составляет 0,5-0,7. Перемешивание среды достигается либо в результате барботажа стерильного воздуха либо турбинной мешалкой со скоростью вращения 300об/мин.
Четвертая стадия (рис.6) процесса осуществляется в основных биореакторах (рис.7) объемом 50м3 в течение 48-52 ч и интенсивной аэрации (80-85 мг О2/(л*мин)). Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28-30С. Такие аппараты должны обеспечить нормальный рост и развитие промышленного продуцента в асептических условиях; они снабжены необходимыми коммуникациями, теплообменниками, перемешивающими устройствами, штуцерами для подачи питательной среды и соответствующим оборудованием для ввода в нее стерильного воздуха, дополнительных питательных ингредиентов, растворов кислот и щелочей для поддержания рН среды на необходимом уровне, системами ввода стерильного пеногасителя и передачи культуральной жидкости на дальнейшую переработку. Перед началом культивирования ферментеры промывают и стерилизуют паром в течение 1 ч при 0,1 МПа.
Стерильная питательная среда (рис.8) в момент введения в биореактор имеет температуру, близкую к среде выращивания продуцента (28-30С), или около 80С. В последнем случае для достижения температуры проведения процесса культивирования жидкую фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата или в теплообменники, расположенные внутри самого ферментера.
Для промышленных штаммов С. glutamicum питательные среды на стадии биосинтеза содержат следующие компоненты (в %):
Меласса 20
Мочевина 2
Калия фосфат двухзамещенный 0,05
Сульфат магния 0,03
Вода остальное
рН 7,0-7,2
Дополнительно в питательную среду вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. Мочевину вводят дробно, по мере потребления, чтобы содержание мочевины в среде не превышало 0,8%.
Посевной материал в количестве 5-10% от объема питательной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения последнего составляет 0,7. Процесс ферментации продолжается при повышенном давлении 0,02-0,03 МПа, постоянной температуре 28-30С и контролируемом значении рН; периодически производится подача стерильного пеногасителя.
В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти все аминокислоты, в этот период образуется практически вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза глутаминовой кислоты – 0,8-1,0 г/л*ч. Питательная среда сильно истощается, возможно значительное изменение рН раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культивирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости образования глутамата.
Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 50 г/л глутаминовой кислоты, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5-1,0%. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45-50%.
Количество накапливаемого глутамата удается повысить, если по мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу процесса дополнительно вводить небольшие количества этих питательных веществ. Организация дробной «подпитки», общий объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фазы, приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной «подпитки» позволяет увеличить концентрацию образующегося в культуральной жидкости глутамата до 60/л.
Рис. 7: Схема ферментатора со вспомогательными устройствами: 1 – корпус ферментатора, 2 – вал смесителя с турбинами, 3 – электродвигатель с коробкой передач, 4 – сальник вала смесителя, 5 – спираль теплообменника, 6 – перфорированный барботер, 7 – устройство для определения расходов воздуха, 8 – фильтр для стерилизации воздуха, 9 – воздушный клапан с регулировочным вентилем, 10 – уловитель, наполненный фенолом, 11 и 12 – резервуары для стерилизации пеногасителя и дополнительной подачи питательной среды во время ферментации, 13 – трубопровод для питательной среды, 14 – выводной вентиль, 15 – вентиль для отбора проб.
Рис. 8: Схема непрерывного приготовления питательной среды: 1 и 2 – резервуары для растворения исходных веществ, 3 – резервуар для смешивания растворов, 4 – насос для передачи среды, 5 – колонна или инжектор для нагрева среды паром, 6 – закрытый сосуд для стерилизации, 7 – охладитель, 8 – резервуар для спуска нагретой воды, 9 – ферментатор
Пятая стадия включает в себя предварительную обработку культуральной жидкости. Осуществляется в результате добавление к ней определенного количества негашеной извести с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.
Шестая стадия – отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением (рис.9). Осадок и отработанную биомассу – в отходы.
Рис. 9: Рамный фильтр-пресс: 1 – лобовина, 2 – рама, 3 – плита, 4 – брус, 5 – подвижная лобовина, 6 – гидравлическое устройство, 7 – прилив, 8 – кран.
Седьмая стадия – осветление фильтрата. Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем.
Восьмая стадия заключается в концентрировании осветленного раствора глутаминовой кислоты. Проводят путем его вакуум-выпаривания (рис.10) при температуре 40-60С, при этом из исходного раствора глутамата отгоняют от 50 до 80% воды.
Рис. 10: Выпарные аппараты: а – с центральной циркуляционной трубой, б – с выносной нагревательной камерой, 1 – корпус, 2 – нагревательные трубки, 3 – циркуляционная труба, 4 – сепаратор, 5 – отбойник.
Девятая стадия – кристаллизация. Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты происходит в изоэлектрической точке. Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 и охлаждения раствора до 4С. После кристаллизации содержание глутамата в продукте составляет 99,6%.
Десятая стадия – получение глутамата натрия. Кристаллы глутаминовой кислоты растворяют в воде, обрабатывают водный раствор активированным углем до полного обесцвечивания при температуре 60-70С. Затем раствор глутаминовой кислоты нейтрализуют 45-50%-ным раствором NaOH до рН 6,8, после чего фильтруют. Фильтрат упаривают на вакуум-выпарной установке при 40-50С, а затем охлаждают. Кристаллизация проводится в течение 3 суток, при плавном снижении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от маточного раствора на центрифуге и высушивают нагретым воздухом. Содержание основного вещества в готовом продукте составляет 98%.
Выделение продукта
Упаренный фильтрат нейтрализованной глутаминовой кислоты постепенно охлаждают в течение 3 суток. Вследствие этого образуются кристаллы глутамата натрия. Их отделяют от маточного раствора на центрифуге и высушивают нагретым воздухом. Содержание основного вещества в готовом продукте составляет 98%.
Центрифуга периодического действия (рис. 11), в которых неоднородная смесь (например, суспензия) вводится в центральную часть полого ротора во время его вращения; твёрдые частицы оседают на внутренней поверхности ротора, а осветлённая жидкость (фугат) отводится из верхней его части. Образовавшийся осадок выгружается из ротора после его остановки (в некоторых случаях на ходу) через специальные сопла или через периодически открывающиеся щели (отверстия).
Рис. 11: Центрифуга: 1 – ротор, 2 – выгружающий шнек, 3 – подвод суспензии, 4 – отвод фугата, 5 – выгрузка осадка.
Основной частью сушилок являются медленно вращающиеся (2—10 об/мин) вальцы, в которые через полую цапфу поступает греющий пар и от них отводится конденсат. Высушиваемый материал поступает на вальцы, налипает на их поверхности тонким слоем, высушивается и срезается ножом.
Рис. 12: Вакуум-сушилки: а – одновальцовая, б – двухвальцовая. 1 – полый барабан (валец), 2 – корпус, 3 – корыто, 4 – распределительный валик, 5 – нож, 6 – шнек, 7 – приемный колпак, 8 – сборник, 9 – вальцы, 10 – наклонные стенки.