Мутагенез
Искусственная изменчивость при воздействии мутагенными факторами, или мутагенами, называется индуцированным мутагенезом. В отличие от естественного мутагенеза при искусственном воздействии мутагенами изменчивость увеличивается в десятки раз. Измененные организмы подвергаются отбору. Порядок и содержание мутационной селекции включает следующие этапы:
1) цель работы;
2) выбор мутагенных факторов;
3) изучение наследственной изменчивости подопытных видов и форм по влияниям мутагенов;
4) определение направления мутационной селекции;
5) производственное испытание, отбор и выбраковка мутантов.
Мутагенные факторы применительно к лесным древесным породам делят на физические и химические. К основным физическим мутагенам относятся: радиация, температурные шоки, ультрафиолетовые лучи. В мутационной селекции наиболее широко применяются ионизирующиеся излучения, которые по своей природе подразделяются на волновые и корпускулярные. К волновым излучениям относятся ультрафиолетовые лучи, рентгеновские лучи и гамма-лучи. К корпускулярным излучениям относятся частицы, протоны, нейтроны, дейтроны и др. Ионизирующие излучения при проникновении в клетку действуют непосредственно на наследственные структуры.
Наименьшей проникающей способностью обладают ультрафиолетовые лучи, рентгеновские и гамма-лучи. Проникающая способность корпускулярных излучений выше, чем у гамма - лучей более чем в 20 раз. Источниками ультрафиолетовых лучей, эффективных при облучении пыльцы, являются ртутно-кварцевые лампы, рентгеновских лучей – рентгеновские установки, гамма-лучей – радиоактивные изотопы (Са и др.), корпускулярных излучений – ядерные колонки.
Химические мутагены, насчитывающие более 400 наименований, разделяют на 5 групп:
1) Ингибиторы азотистых оснований, входящих в состав нуклеиновых кислот. Их действие заключается в подавлении синтеза гуанина и тимина. К ним относятся кофеин, теобромин, этилуретан и др.
2) Аналоги азотистых оснований, также входящие в нуклеиновые кислоты. Они включаются в ДНК на место тимина. Это кофеин, 5-бро-мурацил и др.3) Алкилирующие соединения, вызывающие нарушение точности авторепродукции молекул ДНК под воздействием этих соединений. К ним относятся: иприт, этилметансульфонат-нитрозоэтилмочевина идр.4) Окислители, восстановители и свободные радикалы, вызывающие замену в молекуле ДНК пар оснований А-Т на Г-Ц. Эта группа мутагенов объединяет азотную кислоту, перекиси, альдегиды, соли тяжелых металлов.5) Акридиновые красители, образующие в результате реакции с ДНК комплекс, препятствующий нормальной редупликации.
Химические мутагены вызывают преимущественно генные мутации, физические-генные и хромосомные. Характер мутаций изучают на основе оценки чувствительности растения к мутагену. Оказалось, что слабое воздействие мутагена стимулирует процессы жизнедеятельности растений. С усилением воздействия мутагеном стимулирующий эффект возрастает и достигает предела, затем постепенно падает и снижается до нуля. После этого он оказывает противоположное действие – начинает подавлять процессы жизнедеятельности и тем больше, чем сильное воздействие. Подавляющее воздействие мутагенов возрастает с повышением дозы воздействия до полной гибели клеток, органа или всего растения.
Различают стимулирующие, критические, летальные и оптимальные дозы мутагенов. Дозы мутагена определяются мощностью источника излучения, концентрацией и продолжительностью их воздействия на растения. Дозы, при которых всхожесть семян составляет около 50% контроля, а выживаемость 20-30% числа всходов, называются критическими. Дозы, вызывающие гибель обрабатываемого материала, называются летальными, а дозы, при которых на единицу выживаемости растения получается наибольшее количество мутаций, называются оптимальными.
Чувствительность растений к мутагенам можно оценивать по энергии прорастания семян, всхожести, выживаемости растений, степени плодовитости и стерильности, энергии роста, числу и типу хромосомных перестроек в первом митозе в клетках проростков. По чувствительности к мутагенам древесные растения делят на три группы:
1) чувствительные – кедр сибирский, лиственница, сосна обыкновенная, ели, дуб черешчатый, березы, ольха, смородина черная, шелковица (диплоидная), яблони (грушовка, белый налив) и др.;
2) среднечувствительные – рябина обыкновенная, шиповник, акация желтая, сирень, жасмин, боярышник, жимолость обыкновенная, орех черный, каштан конский, шелковица (тетраплоидная), облепиха (европейского происхождения), яблони (антоновка, пепин шафранный и др.);
3) устойчивые – липа, тополь черный, гледичия, спирея, ракитник, облепиха (алтайская) (Любавская, 1982).
Полиплоидия
Изучение некоторых разновидностей и сортов культивируемых древесных растений показало, что по своей генетической природе они являются аллополинлоидами древних гибридных видов. Между количеством хромосом и свойствами полиплоидных форм не всегда наблюдается прямая связь. Часто диплоидные особи оказываются значительно лучше полиплоидов, полученных от них. Часто диплоидные особи оказываются значительно лучше полиплоидов, полученных от них. Например, тетраплоидные формы березы, тополей, вязов, ольхи и белой акации растут медленнее диплоидных, а триплоидные особи оказались более быстрорастущими. Например, триплоидная осина характеризуется необычайно крупными листьями и исключительно быстрым ростом. Разработаны методы массового искусственного получения триплоидной осины. Опыты показали, что оллополиплоидия дает намного больше возможностей для селекции, чем аутоплиплоидия.
Фертильность определяется порядком прохождения мейоза. У тетраплоидных особей в клетках растения существуют два набора гомологичных хромосом, которые в мейозе группируются по четыре хромосомы. Четыре гомологичные хромосомы из одной группы могут расходиться к противоположным полюсам следующим образом: 2 и 2; 1 и 3; 3 и 1. Дочерние клетки в результате мейоза могут получить не полный или избыточный набор хромосом. Гаметы с несбалансированным набором хромосом, как правило, погибают. Такому стерильному дереву с нарушенным процессом образования гамет можно вернуть плодовитость (фертильность) вмешательством в процесс формирования кариотипа зародыша семян. Это имеет большое значение при отдаленной гибридизации для восстановления фертильности в последующих поколениях ценных гибридов (Любавская, 1982).
Существует правило: если диплоид фертильный, то образованный от него тетрапоид может быть стерильным; если же диплоид стерильный, то производный тетраплоид может быть фертильным. Наряду с этим замечено, что если диплоидный гибрид стерилен или образует варьирующее потомство, то при удвоении числа хромосом он может стать фертильным и хорошо размножаться, так как в этом случае все члены одного набора хромосом полностью соответствуют своим двойникам в другом наборе хромосом. Например, полученный гибрид с диплоидным набором хромосом имеет негомологичные хромосомы, вследствие скрещивания отдаленных в систематическом отношении видов. В результате хромосомы не образуют во время мейоза необходимых гомологичных пар и не распределяются равномерно по полюсам. Вместо этого они могут мигрировать к полюсам в сочетаниях: 2 и 0; 1 и 1; 0 и 1. В каждом случае яйцеклетка или пыльцевое зерно получает несбалансированные наборы хромосом и погибает. Однако, если число хромосом этого гибрида удваивается и образующаяся тетраплоидная особь имеет два полных набора хромосом (по 2п в каждом), получаются гаметы с гомологичными наборами хромосом. В мейозе хромосомы образуют нормальные пары и равномерно распределяются в дочерние клетки. Такое тетраплоидное дерево становится фертильным. Следовательно, в селекционной работе с древесными растениями полиплоидия приобретает большое значение, как метод восстановления фертильности и преодоления явления несовместимости при отдаленной межвидовой гибридизации.
Расщепление у диплоидов может сильно отличаться от расщепления у полиплоидов. Следовательно, и реакция на самоопыление у тетраплоидов и диплоидов может быть разной.
Существующие методы искусственного получения аллополиплоидов можно разделить на две группы: опыление нередуцированными гаметами и индуцирование мутагенами. При нормально протекающем мейозе хромосомное число в клетках уменьшается с 2п до 1п. Иногда редукционного деления не происходит и образуются яйцеклетки или пыльцевые зерна с 2п хромосомами. Если пыльцевое зерно с 2п хромосомами оплодотворит яйцеклетку с гаплоидным набором хромосом, образуется триплоидный эмбрион. Таким образом получают тетраплоидную осину, опыляя крупными триплоидными пыльцевыми зернами женские цветки диплоидных растений. Крупную триплоидную пыльцу отделяют от диплоидной, просеивая пыльцу через тонкую ткань (Любавская, 1982).
Индуцирование полиплоидии в свою очередь проводится тремя способами:
Воздействие нагреванием, высушиванием или холодом. Удвоение соматических хромосом таким путем происходит довольно часто (в 1% или более делящихся клеток). Образующиеся клетки с тетраплоидным набором хромосом обрастают вокруг тканью, и растение в целом остается диплоидным.
Индуцирование колхицином и подофиллином. Они не препятствуют делению хромосом, а подавляют только механизм образования веретена деления, при помощи которого разделившиеся хромосомы мигрируют к полюсам. Поэтому при воздействии этими веществами хромосомы делятся, но не расходятся к полюсам, и диплоидная клетка превращается в тетраплоидную. Колхицин используют в качестве мутагена чаще, чем подофиллин. Обычно его применяют в виде слабого (ОД - 0,5% -ного) водного раствора в течение нескольких часов или дней. Колхицин влияет на любую активно растущую ткань, например на клетки кончика корня или прорастающее пыльцевое зерно. Обработка колхицином часто заканчивается образованием миксоплоидов, или "химер", имеющих и диплоидные, и тетраплоидные ткани. Миксоплоиды могут быть разных типов: одна ветвь тетраплоидная, другая-диплоидная, или верхушка листа диплоидная, а основание тетраплоидное. Если верхушка листа тетраплоидная, а основание диплоидное, то оно растет быстрее и лист заворачивается вверх, если наоборот, то лист заворачивается вниз.
Получение триплоидов из семян. Триплоидные растения древесных видов характеризуются быстрым ростом. Поэтому получение тетраплоидов для последующего перевода их в триплоиды скрещиванием с диплоидоми становится распространенным направлением селекции на гетерозис. Так, в Северной Европе в больших количествах выращивают триплоидные деревья осины, которые получают в результате скрещивания женских клонов тетраплоидных растений с одним из диплоидных мужских клонов. Эту работу, как правило, проводят в теплицах. Дополнительно к этому практикуют посадку одного тетраплоидного клона в центре естественных насаждений мужских диплоидных особей. На деревьях женского клона семена будут триплоидными.
Гаплоидные особи образуются в результате самопроизвольного деления неоплодотворенной яйцеклетки. Такие формы обнаружены как у голосеменных, так и у покрытосеменных. Однако гаплоидные формы древесных пород в селекции не применяются, так как они нежизнеспособны.
Из неоплодотворенных яйцеклеток индуцируют развитие партеногенетических особей после опыления их заранее инактивированной пыльцой. Среду для культуры тканей обычно готовят из агара с добавлением веществ, стимулирующих рост: сахарозы, аминокислот, гормонов растений, минеральных веществ, экстрактов пыльников. Температурный режим и свет - важнейшие факторы при культуре тканей растений. Пыльцевые зерна в культуру тканей берут в период, когда генеративное и вегетативное ядра начинают одновременно делиться. При этом имеется большая вероятность образования триплоидных эмбрионов, чем гаплоидных.
Такие методы успешно используются при работе с травянистыми растениями. Это дает основание полагать, что эти методы можно будет применять и при работе с древесными породами (Любавская, 1982).
Генная инженерия
Одним из важнейших путей изучения культурных растений, занимается генная инженерия. Она направлена на создание новых форм и сортов растений с наследственно закрепленными хозяйственно ценными признаками. Методы генной инженерии обеспечивают высокую точность передачи признаков, в результате сроки получения новых форм и сортов сокращаются.
Актуально применение методов генной инженерии к древесным породам, для которых полученные растения с новым признаком традиционными методами селекции требуют несколько десятков лет. Выполнение гибридного анализа, при работе ДНК древесных растений связано с определенными трудностями. В частности очень большой размер генного ряда виды хвойных растений (Колесниченко, 1989).
Генно-инженерные работы включают две главные группы методов:
Инокулирование растений культурной агробактерией и культивирование эксплантов или протопластов с культурной агробактерией
Эти методы основаны для природного способа инфицирования растения агробактериями. В этом случае эффективность трансформации в значительной мере определяется способностью использования трансформировать данный вид растения.
Методы по культивированию позволяют получить большое количество трансформированных клеток и тканей в строго регулирующих условиях. В отличии от методов инокулирования данные методы требуют регулярного контроля. Методы прямого переноса ДНК в растение. В работе с этим методом необходимо добиться иммобилизации клеток, для чего применяют следующие способы: закрепление клеток в огаре; обработка стеклянной поверхности полиплоидами; использовать присасывающие пипетки. В отличии от других методов прямого переноса ДНК путём микроинъекции возможен перенос целых хромосом.
Инъекции ДНК в молодые цветоносные побеги. Этот метод связан с предыдущими, но в отличии от него перенос ДНК производится не в протопласте или клетки, а в целые растения.
Электропорирование применялось для введения "химерного" гена хлорофениколацетилтрансферазы в протопласты ряда двудольных и однодольных растений.
Химические стимуляторы для введения ДНК в клетки растений используют полиэтиленгликоль и поливиниловый спирт. Эти вещества при высоких значениях pH и наличии ионов Ca индуцируют протопласты к поглощению чужеродной ДНК.
Высокоскоростной микроснаряд для переноса ДНК. Основан на способности молекулярных титановых и вольфрамовых частиц с напыленной на них ДНК на большой скорости через мембрану и проникать в клетку не вызывая ее гибель. Перенос ДНК рибосомами (Колесниченко, 1989).
Заключение
В результате проведенных мной исследований, можно говорить о лиственнице, как об очень ценном дереве, имеющем большое значение в народном хозяйстве.
Она является породой быстрорастущей, оставляя позади сосну и ель. При отборе лиственницы сибирской по коррелятивным признакам можно использовать показатели водного режима хвои, щелочность золы из хвои, электрическое сопротивление клеток.
Виды лиственницы легко скрещиваются между собой. Особенно важны гетерозисные гибриды, отличающиеся более быстрым ростом в сравнении с родительскими видами или отдельными особями одного вида. Такие гибриды были получены в результате скрещиваний лиственницы сибирской с лиственницей японской, лиственницы сибирской с лиственницей европейской и т.д. При контролируемом скрещивании лиственницы сибирской использовалась схема частичного диалельного скрещивания, опыление смесью пыльцы и свободное опыление. Из общего числа полученных семян только 19,4% были полнозернистыми.
Лиственница – дерево однодомное, ветроопыляемое. Цветет лиственница сибирская одновременно с распусканием хвои в мае. Женские и мужские стробилы располагаются по всей кроне на одних и тех же ветках. Семена созревают в сентябре того же года и разлетаются.
В результате обработки семян лиственницы химическими мутагенами повышается их грунтовая всхожесть, сохранность семян, усиливается рост и ветвление корней. Стимуляция линейного роста надземной части растений обнаруживается к третьему году вегетации.
В настоящее время известны три - и тетраплоидные формы лиственницы сибирской. Тетраплоидная форма обычно имеет угнетенный рост, но при последующем скрещивании их с диплоидами образуется триплоидное потомство с эффектом гетерозиса.