Реакции агглютинации
Реакция агглютинации – РА (от лат. agglutinatio – склеивание) – простая по постановке реакция, при которой происходит связывание гомологичными антителами (агглютининами) корпускулярных антигенов – агглютиногенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов) в присутствии электролитов (ИХН). В результате образуются хорошо видимые хлопья агглютината, который выпадает в растворе в виде осадка.
Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для:
1) определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях;
2) определения возбудителя, выделенного от больного;
3) определения групп крови с использованием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.
Для обнаружения антителв сыворотке крови больного ставят развернутую РА: к разведениям сыворотки крови больного добавляют антиген – диагностикум (взвесь убитых микробов определенного вида) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H -антигенов) со специфическими антителами. Реакция агглютинации с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-Аг) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие термолабильный жгутиковый Н-Аг) – крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Обнаружение антител в сыворотке крови является косвенным свидетельством присутствия антигена в организме в данный период времени. Поэтому диагностически достоверным считается четырехкратное и более увеличение титров антител при вторичной постановке теста через 7–10 дней (исследование так называемых «парных» сывороток).
Идентификация чистой культуры. Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную РА, применяя диагностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Антитела для этих реакций (классов IgM или IgG) содержатся в диагностических агглютинирующих сыворотках, полученных путем иммунизации кроликов определенными видами бактерий.
Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диагностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида.
При появлении в капле с сывороткой и микробами хлопьевидного осадка ставят развернутую РА в пробирках с увеличивающимися разведениями агглютинирующей сыворотки в ИХН, к которым добавляют по 2–3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. Титр указан на этикетке препарата. Например, если титр брюшнотифозной видовой сыворотки равен 1:12 800, это значит, что чистая культура бактерий от больного будет идентифицирована как брюшнотифозная только в том случае, если реакция агглютинации будет положительна во всех разведениях сыворотки, включая 1:12 800. Одновременно учитывают контроли: сыворотка, разведенная изотоническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной (контроль сыворотки), взвесь микробов в том же растворе – равномерно мутной, без осадка (контроль Аг).
Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие АТ путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются АТ, специфичные только к определенной бактерии. С адсорбированной или монорецепторной агглютинирующей сывороткой ограничиваются постановкой реакции на стекле. Это обусловлено тем, что такие сыворотки не содержат перекрестно реагирующих групповых антител.
Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест) применяется для выявления неполных (блокирующих) антител. Такое название эти антитела получили в связи с тем, что они имеют один активный центр для связывания с антигеном. Неполные антитела образуются в значительном количестве в организме человека при некоторых хронических инфекциях (бруцеллез, туберкулез, шигеллез и др.), при неинфекционных патологических состояниях: резус-конфликте, аутоиммунных болезнях (красная волчанка, ревматоидный артрит, васкулиты и др.). Обнаружение неполных антител имеет большое значение в диагностике таких болезней. Взаимодействие неполных антител с антигеном in vitro не приводит к образованию макроагрегатов, выявляемых визуально. Поэтому в реакцию Кумбса включают дополнительный компонент – антиглобулиновую сыворотку. Ее получают путем иммунизации кроликов человеческим глобулином. Эта сыворотка содержит бивалентные антитела к глобулинам человека, в том числе и к неполным антителам.
Прямая реакция Кумбса проводится в два этапа. На первом этапе происходит взаимодействие антигена с неполными антителами. Результат этого взаимодействия не виден. На втором этапе комплекс антиген + неполное антитело соединяется антиглобулиновым бивалентным антителом. Последнее может связать две молекулы неполных антител, которые адсорбированы на антигене. В результате образуются хорошо видимые макроконгломераты.
Разработаны две методики проведения реакции Кумбса – прямая, описанная выше, и непрямая. При постановке непрямой реакции используют эритроцитарный диагностикум, представляющий собой взвесь эритроцитов, на поверхности которых адсорбирован антиген. Результатом такого варианта реакции Кумбса будет агглютинация эритроцитов – см. далее.
Реакции преципитации (РП)
Реакции преципитации – РП (от лат. praeci-pito – осаждаться) – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Антиген в РП (преципитиноген) является молекулярным продуктом разрушенных клеток микроорганизмов и хорошо растворим в физиологическом растворе без образования помутнения. Таким антигеном могут быть бактериальный белок, полисахарид, вытяжки из инфицированных органов и др. Степень разведения преципитиногена обычно велика –1:1 млн и более. Результатом взаимодействия такого антигена с антителами- преципитинами является выпадение мелкозернистого осадка или образование кольца (иммунного преципитата) на границе их контакта.
Реакции преципитации являются в основном качественными методами исследования и характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и др.
Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (помутнения). Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципитации вследствие постепенной диффузии реагентов к границе жидкости.
Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации используют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи для выявления сибиреязвенного антигена).
Реакции преципитации в геле. Выделяют несколько вариантов постановки таких тестов:
Двойная радиальная иммунодиффузия по О. Ouchterlony (1948). Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затвердевания в нем вырезают лунки размером 2–3 мм. В эти лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентичных – пересекаются.
Реакция радиальной иммунодиффузии по G. Mancini (1965) используется для количественного определения иммуноглобулинов разных классов, компонентов системы комплемента в сыворотке и др. Принцип метода состоит в следующем: на твердую основу (стеклянную или полистироловую пластинку) наносят слой агара с моноспецифической антисывороткой к одному из классов иммуноглобулинов (антитело). В этом слое делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку пациента, содержащую Ig разных классов (антиген). Антиген из лунок диффундирует в гель, где встречается с гомологичными антителами, что сопровождается образованием вокруг лунки кольцевой зоны помутнения в агаре (преципитат). Площадь этой зоны (или диаметр кольца преципитации) прямо пропорциональна количеству внесенного в лунки антигена (т. е. количеству иммуноглобулина определенного класса), который высчитывают по калибровочной кривой.
Методы иммуноэлектрофореза – сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируя в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации. Т.е., миграция компонентов иммунного комплекса проходит в электрическом поле. Используют методы простого, ракетного или встречного иммуноэлектрофореза.
Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. floccus – хлопья шерсти)– появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин–антитоксин или анатоксин–антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Штаммы C. diphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность, т.е. продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью варианта реакции преципитации в агаре по Оухтерлони.
Реакция нейтрализации (РН)
Реакция нейтрализации токсина антитоксином in vivo основана на способности антител (иммуноглобулинов) нейтрализовать биологическую активность экзотоксинов микроорганизмов (или действие микробов, их антигенов). Экзотоксины продуцируют многие виды бактерий (дифтерийная палочка, возбудители столбняка, газовой гангрены и др.). Они являются активными иммуногенами, которые индуцируют выработку в организме токсиннейтрализующих антител (антитоксинов). Антитела иммунной сыворотки (антитоксины) способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани in vivo и in vitro, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией.
Обнаружение антитоксинов в сыворотке крови больного, а также качественное и количественное определение выделяемого бактериями экзотоксина, присутствие токсина в биологических жидкостях проводится в реакции нейтрализации токсина антитоксином. Для этого смесь иммунной сыворотки и токсина инкубируют в термостате в течение 30–60 мин, а затем вводят чувствительному животному или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). Если токсин нейтрализован антитоксином, то не происходит заболевания и гибели животного (или отсутствие повреждающего действия тест-объектов). В этом случае говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело. Для контроля второму животному вводят смесь токсина и нормальной неиммунной сыворотки. Это животное погибает от действия токсина.
Иммунная электронная микроскопия – электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответствующими антителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов образуется «венчик» из антител, контрастированный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.
Реакции с участием комплемента
Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом антиген-антитело (реакция связывания комплемента, радиального гемолиза и др.).
Реакция лизиса проявляется растворением (лизисом) микроорганизмов или других клеток (эритроцитов) в результате взаимодействия с антителом в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие лизис клеток, называют лизинами: бактериолизинами (разрушают бактерии), спирохетолизинами (разрушают спирохеты), гемолизинами (лизируют эритроциты) и др. Реакции лизиса используются с целью определения вида возбудителей инфекционного заболевания или обнаружения антител в сыворотке крови пациентов. Реакцию ставят в пробирке или на животных. Например, морских свинок используют для проведения феномена Исаева–Пфейфера с целью идентификации холерного вибриона. В пробирочных тестах применяют иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при 37 °С в течение 30 мин для разрушения комплемента, который затем вносят в строго определенном количестве.
В течении реакции лизиса выделяют несколько фаз, которые можно наблюдать под микроскопом:
• потеря подвижности микроорганизмами;
• набухание клеток;
• распад и растворение клеток.
Весь этот процесс занимает 15–20 мин. Большое значение имеет реакция гемолиза – растворение эритроцитов при взаимодействии с антителами-гемолизинами в присутствии комплемента. Гемолизины получают путем иммунизации кроликов эритроцитами животного другого вида (например, эритроцитами барана). Полученная сыворотка, содержащая гемолизины, называется гемолитической. Реакция гемолиза проявляется растворением (гемолизом) эритроцитов барана, при этом взвесь эритроцитов в физиологическом растворе превращается в прозрачную ярко-красную жидкость (лаковую кровь).
Реакция гемолиза ввиду своей демонстративности получила широкое распространение в лабораторной практике. Ее используют для определения титра комплемента и как индикаторную систему в реакции связывания комплемента (РСК).
Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Она основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент (через Fc- фрагмент антител). Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза.
Таким образом, в РСК используют две системы: специфическую, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело + антиген + комплемент, и индикаторную, гемолитическую систему, которая состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к эритроцитам.
Проведение реакции включает две фазы. В первой фазе проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во второй фазе смешивают указанные комплексы, что позволяет выявить наличие свободного комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов.
Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит связывание этим комплексом комплемента. Реакция гемолиза при этом будет отрицательной, так как в гемолитической системе отсутствует свободный комплемент – реакция положительная.
Если же соответствия между антигеном и антителом нет (т.е. нет антигена или антитела в исследуемом образце), комплемент останется свободным и во 2 фазе свяжется гемолитической системой (эритроцит-антиэритроцитарное антитело), результатом чего будет гемолиз эритроцитов – реакция отрицательная.
РСК широко применяется в диагностике инфекционных болезней – сыпного тифа, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде-Жангу), протозойных и вирусных инфекций.
Реакцию радиального гемолиза (РРГ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии антител) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас–нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного.
Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после чего к этому комплексу присоединяются компоненты комплемента, вызывая гемолиз.
Реакция иммунного прилипания (РИП) основана на активации системы комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными иммунной сывороткой. В результате образуется активированный третий компонент комплемента (СЗb), который присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для СЗb, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими СЗb, происходят их соединение и агглютинация.
Методы пассивной агглютинации с использованием носителя
Принцип этих методов состоит в использовании различных неспецифических частиц (эритроцитов, латекса, клеток стафилококка, частиц бентонита, микрокапсул и др.), на поверхности которых адсорбированы молекулы известной специфичности – антигены или антитела. При наличии в растворе комплементарных частиц (антител или антигенов) эти частицы пассивно, за счет взаимодействия специфических компонентов, образуют хорошо определяемые визуально агрегаты.
Реакции этого типа отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать их для ранней диагностики инфекционных болезней. В практике широко применяются реакции трех типов: реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА/РНГА), реакции латекс-агглютинации (РЛА) и реакции коагглютинации.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов животных (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами (антигенный диагностикум) или антителами (антительный диагностикум). Взаимодействие диагностикума с соответствующими АТ или Аг сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки».
Обычно в РНГА выявляют антитела (неизвестные) с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами известного микроба. Диагностикум смешивают в равных количествах с сывороткой больного в разных разведениях. При положительной реакции происходит пассивная агглютинация эритроцитов и наблюдается осадок красного цвета.
Аналогичным образом проводятся исследования на выявление и идентификацию неизвестных антигенов бактерий с использованием антительного эритроцитарного диагностикума, на котором адсорбированы известные АТ. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации – РОНГА).
РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях.
Реакция гемагглютинации (РГА). Гемагглютинины вирусов (например, вируса гриппа) обладают способностью склеивать эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации вирусов. Поскольку РГА происходит без участия иммунной сыворотки (антител), реакция не считается серологической. Однако РГА в серологических исследованиях используют для выбора рабочего разведения антигена, используемого в РТГА.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (феноменингибирования). РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. В этом случае перед внесением эритроцитарного антигенного диагностикума стандартную известную сыворотку инкубируют с исследуемым материалом от больного, затем центрифугируют, отделяют надосадочную жидкость, с которой проводят следующий этап реакции. При снижении титра сыворотки в четыре и более раз констатируют наличие в исследуемом образце соответствующего антигена.
Реакции коагглютинации и латекс-агглютинации проводят аналогичным образом. Различия касаются лишь методик приготовления диагностикумов.
Реакция коагглютинации. Клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков (штамм Cowan), предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие поверхностный белок A, имеющий сродство к Fc -фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
При получении латексных диагностикумов используют химическое связывание белковых молекул (антител или антигенов) с полимерными микрокапсулами или их взаимодействие, основанное на гидрофобных силах. Латексные микрокапсулы могут быть окрашены в различные цвета (голубой, красный, оранжевый и др.). Это облегчает учет результатов, так как образующийся в положительных случаях осадок в виде яркого «перевернутого зонтика» хорошо виден.
Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов. Можно также выявлять неполные АТ против антигенных микробов (например, бруцелл).