Кафедра микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ДЛЯ ОБУЧАЮЩИХСЯ
по дисциплине « Микробиология, вирусология»
для специальности 060103 –Педиатрия (очная форма обучения)
К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ № 1
ТЕМА: «Микроскопический метод исследования. Морфология бактерий.
Простые и сложные методы окраски. Метод Грама»
Утверждены на кафедральном заседании
протокол №___ от «____»_______________20__ г.
Заведующий кафедрой
к.б.н., доцент_______________Перьянова О.В.
Составитель:
ст. преподаватель___________Подгрушная Т.С.
Красноярск
Занятие №1
Тема: Микроскопический метод исследования. Морфология бактерий. Простые и сложные методы окраски. Метод Грама.
2. Форма организации занятия: практическое занятие
Значение изучения темы.
Практические занятия со студентами на кафедре микробиологии проводятся в условиях, аналогичных режиму бактериологической лаборатории. Студентам приходится работать с культурами микроорганизмов. Поэтому они должны знать правила противоэпидемического режима, обеспечивающие личную и общественную безопасность.
Объектами изучения медицинской микробиологии являются микроорганизмы, размеры которых меньше 0,2 мм – величины разрешающей способности глаза как оптического прибора. Поэтому микроскопический метод постоянно применяется в микробиологической практике. Изучение морфологии микроорганизмов ввиду их малой величины возможно только с помощью иммерсионной (погружной) системы микроскопа. Поэтому овладение в совершенстве микроскопическим методом является условием, обеспечивающим успех изучения микроорганизмов.
4. Цели обучения:
- общая: на основе теоретических знаний и практических умений обучающийся должен обладать: способностью и готовностью анализировать социально-значимые проблемы и процессы, использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОК-1), способностью и готовностью к логическому и аргументированному анализу, к публичной речи, ведению дискуссии и полемики (ОК-5), способностью и готовностью выявлять естественнонаучную сущность проблем, возникающих в ходе профессиональной деятельности врача-педиатра (ПК-2), способностью и готовностью к формированию системного подхода к анализу медицинской информации, опираясь на всеобъемлющие принципы доказательной медицины, основанной на поиске решений с использованием теоретических знаний и практических умений в целях совершенствования профессиональной деятельности (ПК-3), способностью и готовностью проводить и интерпретировать результаты современных лабораторно-инструментальных исследований (ПК-5), способностью и готовностью использовать основные методики клинико-иммунологического обследования для своевременной диагностики заболеваний и патологических процессов (ПК-16), способностью и готовностью изучать научно-медицинскую информацию, отечественный и зарубежный опыт по тематике исследования (ПК-31), способностью и готовностью к участию в освоении современных теоретических и экспериментальных методов исследования с целью создания новых перспективных средств в педиатрии, в организации работ по практическому использованию и внедрению результатов исследований (ПК-32).
- учебная:
знать
1. Правила работы в микробиологической лаборатории.
2. Суть микроскопического метода исследования и его назначение.
3. Морфологию и структуру микроорганизмов.
4. Простые и сложные методы окраски микроорганизмов.
5. Метод Грама и его назначение.
уметь
1. Готовить фиксированные препараты из культур микроорганизмов, растущих на плотных и жидких питательных средах.
2. Окрашивать препараты простыми методами и по методу Грама.
3. Микроскопировать, дифференцировать микроорганизмы по морфо-тинкториальным свойствам и интерпретировать полученные результаты.
владеть микроскопическим методом исследования и навыкамиокраски по методу Грамма; интерпретировать полученные результаты.
5. План изучения темы:
5.1 Контроль исходного уровня знаний:
- собеседование по контрольным вопросам:
1. Классификация царства прокариот.
2. Морфология бактерий: форма, величина, взаимное расположение.
3. Простые и сложные методы окраски; их информативность.
4. Метод Грама: методика, механизм и его назначение.
5. Типы микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный и др.) и специальные методы микроскопии (темнопольная, фазовоконтрастная).
6. Устройство биологического микроскопа. Разрешающая способность микроскопа.
7. Правила работы с иммерсионной системой.
Тесты
1. ОСНОВОПОЛОЖНИК НАУЧНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
1) А. Левенгук
2) Луи Пастер
3) Г.Н. Габричевский
2. МИКРОСКОПИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ИЗУЧАЮТ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ
1) морфо-тинкториальные
2) культуральные
3) антигенные
4) токсигенные
5) биохимические
3. РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА – ЭТО
1) способность давать раздельное изображение двух близко расположенных точек
2) возможность наблюдать движение объекта
3) возможность определять размеры объекта
4) показатель преломления иммерсионной системы
5) увеличение, которое позволяет рассмотреть объект
4. СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ ВКЛЮЧАЕТ В СЕБЯ СЛЕДУЮЩИЕ РАЗНОВИДНОСТИ
1) ФАЗОВО-КОНТРАСТНУЮ МИКРОСКОПИЮ
2) ЭЛЕКТРОННУЮ МИКРОСКОПИЮ
3) ТЕМНОПОЛЬНУЮ МИКРОСКОПИЮ
4) МИКРОСКОПИЮ В ЗАТЕМНЁННОМ ПОЛЕ
5) ИММЕРСИОННУЮ МИКРОСКОПИЮ.
ВЫБЕРИТЕ ЕДИНСТВЕННУЮ КОМБИНАЦИЮ, В КОТОРОЙ УЧТЕНЫВСЕ ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ
1) 1, 3, 4, 5
2) 1, 2, 4,5
3) 2, 3, 4, 5
4) 2, 3, 4
5) 3, 4, 5
5. ТЕМНОПОЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ ПРИМЕНЯЕТСЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
1) кишечной палочки
2) бледной трепонемы
3) стафилококка
4) хламидий
5) риккетсий
6. ПРЕДЕЛ РАЗРЕШЕНИЯ СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА
1) 200 мкм
2) 0,01 мкм
3) 0,2 мкм
4) 1-2 мкм
5) 10 мкм
7. ПРЕДЕЛ РАЗРЕШЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЛАЗА
1) 200 мкм
2) 100 мкм
3) 10 мкм
4) 1-2 мкм
5) 0,1 мкм
8. ДОСТОИНСТВО ИММЕРСИОННОЙ СИСТЕМЫЗАКЛЮЧАЮТСЯ В
1) увеличении разрешающей способности светового микроскопа
2) получении объемного изображения
3) большем увеличении объектива
4) большем увеличении окуляра
5) использовании УФ-лучей
9. СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫОКРАСКИ ИСПОЛЬЗУЮТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
1) подвижности бактерий
2) биохимических свойств бактерий
3) антигенных свойств бактерий
4) структуры микробной клетки
5) вирулентности бактерий
10. ОСНОВНОЙ МЕТОД ОКРАСКИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
1) метод Грама
2) окраска фуксином
3) метод Циля-Нильсена
4) окраска метиленовой синькой
5) метод Романовского
11. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ ЗАВИСИТ ОТ
1) состава питательной среды
2) консистенции питательной среды
3) клеточной стенки
4) используемых красителей
5) способа фиксации препарата
12. ПО ФОРМЕ МИКРООРГАНИЗМЫПОДРАЗДЕЛЯЮТСЯ НА
1) диплококки, стрептококки, стафилококки
2) бациллы, бактерии
3) палочки, кокки, микоплазмы
4) кокки, палочки, извитые
5) клостридии, бациллы
13. К КОККОВЫМ ФОРМАММИКРООРГАНИЗМОВ ОТНОСЯТСЯ
1) N EISSERIA MENINGITIDIS
2) K LEBSIELLA PNEUMONIAE
3) STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
4) BACTEROIDES FRAGILIS
5) S TAPHYLOCOCCUS AUREUS.
ВЫБЕРИТЕ ЕДИНСТВЕННУЮ КОМБИНАЦИЮ, В КОТОРОЙ УЧТЕНЫВСЕ ПРАВИЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ
1) 1,2,3
2) 1,3,5
3) 2,3,4
4) 2,4,5
5) 3,4,5
14. ДОСТОИНСТВА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО МЕТОДА ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
1) возможность ускоренной диагностики
2) простота и доступность метода
3) при некоторых заболеваниях имеет самостоятельное диагностическое значение
4) позволяет выявить клинически значимое количество условно-патогенных микроорганизмов
5) все вышеперечисленное
Основные понятия и положения темы.
Микробиология – это наука о мельчайших живых организмах невидимых невооружённым глазом. Мир микробов открыл голландский коммерсант Антони ван Левенгук (1675). Это стало возможным, благодаря созданным им микроскопам.
Микроскопический метод исследования – это метод предусматривающий наблюдение за микроорганизмами с помощью микроскопа (от греч. micros – малый, scopeo – рассматривать, наблюдать). Микроскоп характеризуется увеличением и разрешающей способностью. Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Пределом разрешения называется наименьшее расстояние между двумя точками, при котором их можно видеть раздельно. Именно этим расстоянием и определяется максимальное полезное увеличение светового микроскопа.
Величину предельного разрешения определяют по формуле d=0,5 l/N sina, где l - длина волны используемого источника света, a - половина угла линзы объектива, т.е. угла между лучами, идущими от объекта к краям объектива, N – показатель преломления среды между объектом (препаратом)и объективом. Знаменатель (N sina) называют числовой апертурой. При использовании иммерсионного масла и иммерсионных линз апертура составляет 1,25. При использовании видимого света с длиной волны около 426 нм, разрешающая способность микроскопа составляет около 200 нм или 0,2 мкм. Разрешающая способность глаза составляет около 200 мкм или 0,2 мм.
Для увеличения контрастности микроорганизмов применяют окрашивание. Большинство методов окрашивания вызывает гибель клеток и поэтому перед окрашиваем микробные клетки фиксируют. Это позволяет уменьшить структурные изменения в клетках после их гибели.
Метод окраски, при котором применяется лишь один краситель, называется простым.
Метод окраски, при котором применяется два и более реактива, называется сложным. В микробиологической практике этот метод имеет дифференциально-диагностическое значение.
Важным таксономическим признаком бактерий является их отношение к окраске по Граму. Оно связано с особенностями строения и состава клеточной стенки.
5.3. Самостоятельная работа по теме:
Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов, растущих на плотных и жидких питательных средах.
Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает:
1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.
1. Приготовьте предметное стекло, спиртовку, пробирку с физиологическим раствором, бактериологическую петлю и пробирки с исследуемыми культурами, растущими на плотных и (или) жидких питательных средах. Зажгите спиртовку, предварительно ее проветрив, приподняв фитиль и канюлю. Спиртовка должна находиться прямо перед Вами, на удобном для работы расстоянии. Для стерилизации бактериологическую петлю прокалите в пламени спиртовки, остудите сначала в воздухе в течение 2-3 с., затем о внутреннюю поверхность пробирки (ниже верхней трети длины). Заберите бактериологической петлей физиологический раствор (0,9% р-р NaCl) и нанесите каплю на чистое обезжиренное предметное стекло. Стекло должно находится в чашке Петри; категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! Вновь прокаленной и остуженной петлей возьмите немного биомассы, прикоснувшись к ней петлей. Культуру суспензируют в капле физиологического раствора до появления легкой мути, после чего остатки биомассы на петле необходимо высушить и сжечь в пламени спиртовки. Микробную взвесь на стекле распределите остуженной петлей тонким равномерным слоем на площади диаметром 1-1,5 см. После приготовления мазка петлю сразу обязательно прокалите и поставьте в штатив.
Мазок из жидкой культуры №2 готовят также, но без использования физиологического раствора. Препарат из культур №3 и №4 готовится в том же порядке с последовательным внесением исследуемых культур.
2. Полученный препарат высушите на воздухе в чашке Петри. Запрещается покидать рабочее место и оставлять мазок без присмотра!
3. Высушенный препарат зафиксируйте путем 3-х кратного проведения через пламя спиртовки мазком вверх так, чтобы общее время пребывания его в пламени было около 6 с. Контролем правильности фиксации препарата служит прикосновение стекла к тыльной стороне ладони; стекло должно быть горячим, а не теплым. В противном случае фиксацию необходимо повторить. После того, как стекло остынет, границы мазка обведите стеклографом с нижней стороны. Цели фиксации: инактивация микроорганизмов; прикрепление микроорганизмов к стеклу; улучшение проникновения красителя внутрь микробной клетки.
4. Фиксированный препарат из культуры №1 окрашивается метиленовой синькой Леффлера: для этого нанесите краску на мазок и через 3-5 мин смойте водой. Препарат высушите фильтровальной бумагой.
Препарат из культуры №2 окрасьте водным фуксином Пфейффера (1:10) в течение 1-2 мин.
Препарат из смеси культур №3 и №4 окрасьте по методу Грама: поместите на препарат бумажку, пропитанную раствором генцианвиолета (модификация Синева), смочите ее водой, через 1-2 мин бумажку снимите, а краску слейте; налейте раствор Люголя на 1 мин, слейте; обесцветьте 96°спиртом в течение 10-30 сек. до прекращения отхождения струек краски; промойте водой; докрасьте водным фуксином (1:10) в течение 1-2 мин, промойте водой; высушите фильтровальной бумагой.
Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные – в розово-красный цвет, что связано с особенностями строения и состава клеточной стенки.
Для получения достоверного результата при окраске по методу Грама необходимо точно соблюдать правила приготовления мазков, продолжительность окраски и обесцвечивания спиртом. Толстые, густые мазки будут окрашиваться неравномерно и заведомо грам (-) бактерии могут окраситься грамположительно. При окраске тонких мазков основная ошибка заключается в «переобесцвечивании» мазка спиртом и поэтому грам (+) бактерии окрашиваются грам (-). Имеет значение и возраст культуры. В старых культурах грам (+) бактерии могут окраситься грам (-).