Очевидно, что распределение близко идущих зон белков будет тем успешнее, чем тоньше сами эти зоны. Поэтому при электрофорезе следует заботиться об уменьшении толщины белковых зон. Это накладывает ограничение на допустимую загрузку каждого трека пластины геля. В качестве ориентировочного максимума можно принять загрузку в 50 мкг белка в карман шириной в 5 мм для пластины толщиной в 1 мм. Идентификацию полос белка по их окраске можно проводить и при загрузках в 10 раз меньших. При перегрузке белковые полосы бывают резкими в передней своей части и размытыми сзади. В этом случае всегда следует считаться с возможностью выпадения белка в осадок в момент вступления его в гель, когда все макромолекулы стягиваются в тонкую полоску и локальная их концентрация сильно увеличивается.
В простом варианте электрофореза желательно наносить белковую смесь на гель в минимальном объеме, чтобы высота исходного слоя в кармане была не более, чем 2-3 мм. Исходя из цифры загрузки в 50 мкг можно подсчитать цифру исходной концентрации белкового препарата в 3-5 мг/мл.
Улучшения разрешения зон можно добиться путем принудительного концентрирования исходного препарата белка в тонкую полоску в момент его вхождения в гель. Основной прием заключается в том, чтобы создать перед гелем область с повышенной напряженностью электрического поля, где белки мигрируют намного быстрее, чем в рабочем геле. На границе перехода из этой области в гель они будут стягиваться в тонкую полоску, так как находившиеся первоначально далеко позади молекулы белка догонят впереди идущих, замедливших свое движение при вступлении в рабочий гель. Повышения напряженности поля в области кармана, где находится исходный препарат очень просто достигнуть путем растворения этого препарата в рабочем буфере, но в 5—10 раз менее концентрированном (меньшей молярности), чем в геле и верхнем резервуаре. Благодаря уменьшению числа носителей заряда (например ионов С1) резко увеличивается локальное сопротивление слоя, содержащего препарат, а значит и напряжение на нем по сравнению с участком такой же длины в геле. Смешиванию с буфером верхнего резервуара в кармане помешает присутствие сахарозы в препарате.
Другим очень эффективным, но более сложным способом сужения полос уже в ходе их миграции является использование градиента пористости геля в направлении уменьшения среднего размера пор при продвижении к нижнему краю пластинки.
Предположим, что еще при формировании рабочего геля нам удалось создать такой градиент пористости. Сделать это можно с помощью относительно простого устройства, изображенного на рис. 4.
|
|
Рис.4
В левом из двух сообщающихся между собой (у самого дна) стаканов находится смесь жидких компонентов будущего геля низкой концентрации (например. Т=5%), а в правом— высокой концентрации (Т==20%). В первом из стаканов вращается магнитик мешалки (М). Из левого стакана жидкость поступает в перистальтический насос (Н), который медленно через трубочку (Тр) подает ее на дно формы для геля (Ф).
Если стаканы одинакового диаметра были залиты первоначально до одинакового уровня, а суммарный объем жидкости в них равен объему формы, то на дно ее будет поступать постепенно все более плотная жидкость, которая, растекаясь по дну, станет оттеснять вверх все более легкие слои. В итоге, после полимеризации у дна окажется мелкопористый 20%-ный гель, а наверху — крупнопористый, 5%-ный. Изменение это будет линейным по высоте пластины.
При миграции белковых зон в таком «градиентном» геле передний край каждой полосы будет постоянно оказываться в области чуть-чуть более концентрированного геля, чем ее задний край. Молекулы белка, расположенные ближе к переднему краю полосы будут тормозиться трением о гель сильнее, чем идущие сзади, что и приведет к непрерывному сужению полос в ходе их продвижения вниз по гелю.
Существует множество фирменных приборов для проведения электрофореза белков в вертикальных пластинках. В некоторых из них предусмотрено охлаждение поверхностей стеклянной формы геля, например, током буфера, прокачиваемого между резервуарами. Проблемы теплоотвода от геля мы коснулись, говоря о недостатках гелей в трубочках. Для пластин с толщиной геля в 1 мм естественное воздушное охлаждение является вполне достаточным. Для более толстых гелей охлаждение циркулирующей водной средой оправдано.
Некоторые фирмы выпускают приборы для электрофореза в горизонтально расположенных пластинах. В этом есть свои преимущества. К примеру, пластину с гелем можно положить на охлаждаемый столик. Но есть и недостатки. Хотя бы уже упомянутое обсыхание фитилей, без которых в этих системах нельзя обойтись. А также необходимость защиты от обсыхания и самого геля, который в этих вариантах открыт сверху для наложения фитилей (гель лежит на одной пластинке). Препараты в этих моделях вносят в «колодцы», расположенные с одного края геля перпендикулярно его плоскости. Можно их расположить и на середине геля для того, чтобы в одном опыте разделять и основные, и кислые белки — они будут мигрировать в разные стороны. С проблемой обсыхания стараются справиться закрывая весь прибор (резервуары, фитили и гель) герметической крышкой из плексигласа.