Определение коллагена в мясе по методу В.П. Воловинской

1. Сущность метода

Экстрагирование фракции коллагеновых белков с последующим определением в экстрактах белкового азота.

2. Техника определения

Измельченный образец ткани массой 10 г растирают с 50 см³ раствора хлорида натрия массовой долей 0,6%. Полученную смесь переносят в центрифужную пробирку, ополаскивая ступку и пестик 50 см³ того же раствора. Смесь экстрагируют в течение 1 ч, затем центрифугируют в течение 15 мин при частоте вращения 33 – 50 с^-1. Жидкую фракцию удаляют, а к осадку прибавляют 100 см³ раствора гидроксида натрия массовой долей 0,2%. Через 12 – 24 ч после тщательного перемешивания жидкую фракцию отделяют центрифугированием. Остаток ткани обрабатывают щелочью еще 2 раза, каждый раз добавляя по 50 см³ раствора гидроксида натрия массовой долей 0,2%.

Остаток ткани из пробирки количественно переносят в стакан, смывая раствором гидроксида натрия массовой долей 0,1% (объем раствора гидроксида натрия 100 см³). Содержимое стакана нагревают при умеренном кипении в течение 30 мин, по возможности сохраняя объем жидкости ву стакане периодическим добавлением горячей воды. Затем частицам ткани дают возможность осесть на дне стакана, и в горячем виде жидкость осторожно декантирует с осадка в мерную колбу вместимостью 200 см³ через воронку с небольшим количеством ваты, предварительно проверенной на содержание азота.

Остаток в стакане вместе с ватой, через которую проводилось фильтрование, при кипении обрабатывают водой, для чего в стакан наливают 100 см³ горячей дистиллированной воды и при умеренном кипении раствор сгущают за 1,5 – 2,0 ч до 1/3 первоначального объема. Сгущенный раствор через 15 – 20 мин декантируют с осадка через вату в ту же мерную колбу вместимостью 200 см³.

Аналогично при кипении остатки ткани обрабатывают водой еще 2 раза. После последней экстракции вату промывают водой, и промывные воды присоединяют к общему объему экстракта.

Собранный в мерную колбу экстракт подкисляют уксусной кислоты массовой долей 20% до рН 4,8, нагревают до 50 и после охлаждения доводят водой до метки. При подкислении выпадает небольшое количество белков, от которых освобождаются фильтрованием через бумажный фильтр. Из фильтра берут 20 см³ и после минерализации определяют азот.

Минерализат охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см³, объем доводят до метки дистиллированной водой, содержимое перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 100 см³ вносят 5 см³ полученного раствора минерализата, повторно доводят объем до метки дистиллированной водой. Для проведения цветной реакции 1 см³ вторично разбавленного минерализата вносят в пробирку, добавляют последовательно 5 см³ реактива 1 и 5 см³ реактива 2, содержимое пробирки перемешивают. Одновременно готовят контрольный раствор, используя при этом контрольный минерализат (проба с использованием дистиллированной воды). Через 30 мин определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Измерение проводят в сравнении с контрольным раствором.

3. Расчет

Построение калибровочного графика

Для построения графика используют стандартный раствор сульфата аммония, для приготовления которого берут 0,236 г сульфата аммония, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 60 , вносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Этот раствор является стандартным и содержит 0,1 мг азота в 1 см³.

В мерные колбы вместимостью по 100 см³ вносят следующие объемы стандартного раствора (см³): 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0. После доведения объемов растворов в колбах дистиллированной водой до метки получают серию рабочих растворов концентрацией 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мкг азота в 1 см³.

Для проведения цветной реакции в пробирки помещают по 1 см³ рабочего раствора, добавляют 5 см³ реактива 1 и 5 см³ реактива 2, перемешивают и через 30 мин измеряют величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 625 нм или на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром с толщиной поглощающего свет слоя 1 см по отношению к контрольному опыту. Опыт повторяют три раза. Для каждого определения готовят новый стандартный раствор.

По полученным средним данным из трех стандартных растворов строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию азота (с, мкг/см³), а на оси ординат – соответствующую ей оптическую плотность (D) при длине волны 750нм. Проходит через начало координат.

По полученной величине оптической плотности с помощью калибровочного графика определяют концентрацию азота.

Массовая доля белка (%)

где с – концентрация азота, найденная по калибровочному графику, мкг/см³; 250 – объем минерализата после первого разведения, см³; 100 – объем минерализата после вторичного разведения, см³; m – масса навески, г; 5 – объем разбавленного минерализата для вторичного разведения, см³; 1 – объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см³; – множитель для перевода микрограммов в граммы; 100 – коэффициент для перевода в проценты; 6,25 – коэффициент для пересчета на белок.

Массовую долю азота в коллагене (%) вычисляют по формуле

,

где a – массовая доля азота в 20 см³ фильтрата, %; m – масса навески ткани, г.

Коэффициент перерасчета азота на коллаген равен 5,62.