1. Сущность метода
Метод основан на предварительном гидролизе коллагеновых полипептидов с последующим проведением качественной цветной реакции на оксипролин и фотометрированием. Включает следующие операции: гидролиз ткани соляной кислотой в присутствии хлорида олова, нейтрализацию кислоты и удаление олова, окисление оксипролина, развитие цветной реакции с пара-диметиламинобензальдегидом, измерение интенсивности окраски фотометрированием.
2. Техника определения
Навеску мяса массой 4 г вносят в колбу Кьельдаля вместимостью примерно 100 см3 со шлифом для присоединения обратного холодильника. К навеске добавляют 7 см3 воды, 10 см3 соляной кислоты молярной концентрацией 12 моль/дм3 и 0,7 г хлорида олова (II).
К колбе присоединяют пришлифованный шариковый холодильник и включают воду. Нагревание ведут на воздушной песчаной бане. Для воздушной бани удобно использовать колбонагреватель. С момента закипания жидкость нагревают ровно 7 ч, после чего плитку выключают и отставляют от колбы. Еще теплую колбу отсоединяют от холодильника, и содержимое переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см3. Исходную колбу несколько раз ополаскивают водой.
Для ускорения процесса гидролиз проводят в автоклаве. Навеску мяса массой 4 г вносят в ампулу вместимостью 25 см3 через расширенную часть горлышка. К навеске добавляют 7 см3 воды, 10 см3 концентрированной соляной кислоты и 0,7 г хлорида олова (II). Ампулы запаивают на горелке и помещают в автоклав температурой 112 – 114 
на 3,5 ч, после чего их можно хранить длительное время.
Содержимое ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, остатки смывают дистиллированной водой.
Содержимое мерной колбы независимо от способа гидролиза нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 6 моль/дм3, а затем доводят насыщенным раствором карбоната натрия до рН 8,0 – 8,2. После образования белого осадка начинают контролировать рН, используя рН-метр со стеклянным электродом или универсальный индикатор и фенолфталеин.
При работе по последнему способу из колбы отбирают тонкой стеклянной палочкой одну каплю жидкости и помещают ее на пластинку из молочно-белого стекла. Добавляют несколько капель дистиллированной воды и одну каплю универсального индикатора. После того как по универсальному индикатору рН жидкости будет близок к 7,5, добавляют несколько кубических сантиметров раствора карбоната натрия. Обработка считается законченной, если капля раствора, смешанная с водой, окрасится в чуть заметный розовый цвет (по фенолфталеину).
Колбу с жидкостью быстро охлаждают, объем доводят до метки дистиллированной водой и оставляют в покое в течение 30 мин. Затем осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера при слабом разрежении.
Если фильтр мутный, его вторично фильтруют через тот же самый фильтр. Фильтрат светло-желтого цвета должен быть совершенно прозрачным. Одновременно гидролизуют, а затем нейтрализуют и фильтруют несколько проб.
В пробирки отмеряют пипетками по 1 см3 растворов в указанном порядке: исследуемый фильтрат, раствор сульфата меди молярной концентрацией 0,01 моль/дм3, раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм3, раствор пероксида водорода массовой долей 6%. Одновременно проводят три контрольных опыта, в которых исследуемый фильтрат заменяют 1 см3 дистиллированной воды.
Растворы в пробирках перемешивают, периодически встряхивая, в течение 5 мин. Затем пробирки помещают на водяную баню при 80 на 5 мин, часто и энергично встряхивая их. При этом пробирки должны быть глубоко погружены в воду. По окончании нагревания пробирки охлаждают на водяной бане со льдом и добавляют в каждую при перемешивании 4 см3 раствора серной кислоты молярной концентрацией 3 моль/дм3, а затем при сильном перемешивании 2 см3 раствора пара -диметиламинобензальдегида.
Далее пробирку помещают на водяную баню при 70 на 16 мин, после чего охлаждают водопроводной водой (под краном) и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 560 нм или фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Измерения сравнивают с контрольным опытом. Предварительно измеряют оптическую плотность двух контрольных растворов. Третий контрольный раствор служит запасным, его используют только в случае расхождения в показаниях первых двух растворов.
3. Расчет
Построение калибровочного графика
Растворы оксипролина концентрацией 0,5 – 25,0 мкг/см3 подвергают всем операциям согласно описанию метода, начиная с гидролиза, так как в процессе последнего некоторое количество оксипролина разрушается.
По калибровочному графику находят концентрацию оксипролина в объеме жидкости, находящейся в пробирке после добавления пара -диметиламинобензальдегида (10 см3).
Массовую долю оксипролина в исследуемом образце (мг%) рассчитывают по формуле
,
где c – концентрация оксипролина в 10 см3 окрашенного раствора, определенная по калибровочному графику, мг; 100 – объем раствора, полученный после нейтрализации, см3; 100 – множитель для перевода в проценты; V – объем раствора для цветной реакции, см3; m – масса навески мяса, г.
При содержании оксипролина до 25 мкг в 10 см3 окрашенного раствора в исследуемом образце можно работать без калибровочного графика, пользуясь формулой:
,
где D – оптическая плотность; 0,01 – количество оксипролина, соответствующее 0,164 оптической плотности; 100 – объем раствора после нейтрализации; 100 – множитель для перевода в проценты; 0,164 – величина оптической плотности, полученная для чистого оксипролина; V – объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см3; m – масса навески мяса, г.
Для пересчета содержания соединительнотканных белков в массовые доли от общего содержания белков используют уравнение
,
где 8,07 – коэффициент пересчета оксипролина на белки соединительной ткани; x – массовая доля оксипролина, %; 6,25 – коэффициент пересчета на белки; N – массовая доля общего азота в мясе, %.
Список литературы
Л. В. Антипова, И. А. Глотова, И. А. Рогов «Методы исследования мяса и мясных продуктов». - М., КолосС, 2004