Впервые зрелый межвидовой гибрид, полученный в результате парасексуальной гибридизации протопластов 2 сортов табака (Nicotiana glauca, c 24 хромосомами и N.langsdorfii c 18 хромосомами), описан Карлсоном в 1972 г. Каллус амфиплоидного гибрида мог расти на безгормональной среде. Гибридное растение цвело. С тех пор были получены жизнеспособные внутривидовые, межвидовые, межродовые гибриды.
Осуществлено слияние протопластов культурного картофеля сорта Приекульский ранний (Solanum tuberosum) с протопластами дикого картофеля (S. chacoense). Известно, что у дикого картофеля клубни очень мелкие. Вместе с тем, растение устойчиво ко многим заболеваниям. Картофель сорта Приекульский ранний образует крупные клубни, но растения этого сорта восприимчивы к болезням. Размеры протопластов у этих растений разные. Соматические гибриды по форме листьев и кустов, размеру клубней занимали промежуточное положение между культурными и дикими растениями. Вместе с тем гибрид, полученный в результате соматической гибридизации, оказался устойчивым к вирусу «У», чем отличался от полового гибрида.
Первая попытка по созданию межродовых гибридов принадлежит Г. Мельхерсу, создавшему в 1978 году гибрид картофель + томат, так называемый томатофель. Гибрид был стерилен, морфологически аномален: толстые корни, отсутствие типичных столонов, махровые цветки. Было еще несколько попыток получения таких гибридов, но все растения стерильны. Эти эксперименты показали ограниченность применения парасексуальной гибридизации для прикладной селекции. Японскими исследователями (Х. Кисака с соавт., 1997) путем электрослияния протопластов ячменя и риса был получен межродовой соматический гибрид. Протопласты риса получали из суспензионной культуры, а протопласты ячменя были изолированы из молодых листьев. Часть полученных каллусов сформировали зеленые участки и побеги. Только один побег сформировал корни, и это растение было успешно перенесено в почву. По морфологии было близко к растениям риса. Цитологический анализ показал, что растение имело и маленькие хромосомы от риса, и большие от ячменя. Были проанализированы также митохондриальная и хлоропластная ДНК. Растение содержало новые последовательности и в митохондриальной, и в хлоропластной ДНК, которые не обнаруживались ни в одном из родителей.
Ю. Ю. Глебой с сотрудниками проводились многочисленные эксперименты по созданию межтрибных гибридов. Триба - таксономическая единица между семейством и родом. Получены удачные гибриды между Arabidopsis и Brassica (турнепс) - Arabidobrassica. У гибридных линий индуцировали морфогенез корней и растения. Растения генетически и морфологически униформны, не цвели. На вид - уродливы, очень много тератомоподобных образований, похожих на цветки.
Была осуществлена гибридизация 2-х родов пасленовых Datura innoxia + Atropa belladonna. Удалось регенерировать растения. Во всех случаях выявлены хромосомы обоих родительских видов. Амфиплоиды оказались неспособны к стеблевому морфогенезу, в линиях с полиплоидным и анеуплоидным наборами хромосом получали аномальные стебли. Регенерировавшие растения были стерильны, похожи на дурман, но содержали небольшое количество хромосом красавки.
В других экспериментах сливали протопласты красавки с каллусными клетками китайского табака. Получили 12 клонов. В клетках всех клонов обнаружили хромосомные типы обоих родителей, через год только у двух клонов происходила полная элиминация хромосом красавки.
Морковь + сныть: из образовавшейся каллусной ткани через полгода регенерировали аномальные растения. Одно из них цвело, но у цветка отсутствовали пыльники и пестик.
Интересные эксперименты были проведены в этой же лаборатории по гибридизации хлорофиллдефектного табака с красавкой. После слияния получили 40 фотосинтезирующих колоний, из них 4 клеточных линии дали нормальные растения красавки, 4 - аномальные по морфологии гибриды табак + красавка, остальные - зеленые, иногда пестролистные растения, идентичные табаку, которые цвели, давали семена. Они содержали хромосомы табака и пластиды красавки. Это были первые фертильные межтрибные гибриды.
Первые работы по получению межсемейственных гибридов проведены К.Као и В.Веттером в 1976-77 гг. (соя + табак). Позднее в лаборатории Ю.Ю.Глебы провели аналогичные эксперименты пасленовые + бобовые и лилейные (горошек + табак и лук + табак). И.Ф.Каневскому удалось индуцировать морфогенез стеблеподобных тератом в культуре межсемейственных гибридов N.tabacum + Vicia faba.
Практически во всех случаях наблюдалась видоспецифичная элиминация хромосом одного из родителей. В культурах межсемейственных гибридов наблюдалось много многоядерных клеток, клеток с мини ядрами, в метафазах делений встречались гигантские хромосомы. Отмечена асинхронность в расхождении родительских хромосом в анафазе. Морфогенез у такого материала отмечен не был.
Для отдаленных гибридов характерно:
1. Относительная стабильность гибридного состояния, при котором не наблюдается полной элиминации генетического материала одного из родителей.
2. Генетические перестройки (реконструкция и частичная элиминация хромосом).
3. Генетическая разнокачественность клонов гибридных клеток.
4. Ограниченная морфогенетическая способность.
Изучение межцарственных гибридов клеток "животное + растение" показало, что на этапе слияния видоспецифичность не проявляется, поэтому можно слить даже животную и растительную клетки. На более поздних этапах онтогенеза эти различия сказываются, что было установлено в экспериментах по слиянию протопластов арабидопсиса и табака с лимфоцитами человека. При этом происходило слияние цитоплазмы, ядра не сливались. Эдвард Коккинг параллельно проводил изучение ультраструктуры таких гибридов, работая с клетками амфибий и протопластами моркови. После объединения клеток ядра амфибии были окружены тонким слоем собственной цитоплазмы, но уже через 48 часов отмечалось полное смешивание цитоплазмы и регенерация клеточной стенки вокруг гетерокариона.
Конструирование клеток
Протопласты широко используются также в качестве реципиентов для клеточных органелл. В 1973 году И. Потрикусс и Ф. Хоффман успешно трансплантировали изолированные ядра петуньи в протопласты табака. Каким образом можно ввести ядро или другие клеточные органеллы в протопласт?
При использовании сэндвич-метода трансплантацию проводят в условиях слабого деплазмолиза протопласта. Перед введением протопласты и ядра обрабатывают лизоцимом, который модифицирует клеточную мембрану. Далее осуществляют попеременное осаждение ядер и протопластов центрифугированием. В результате центрифугирования в пробирках формируется несколько чередующихся слоев. Центрифужные пробирки заполняют раствором осмотика (маннита) без лизоцима и центрифугируют полчаса при 140 g, оставляют на 2 часа при температуре +4оС. Осадок ресуспендируют и просматривают под микроскопом. Ядра можно обнаружить и в цитоплазме, и в вакуолях. В некоторых случаях при поглощении ядра образуются жизнеспособные гибриды, в других - в клеточном цикле происходит потеря интеграции между чужеродным ядром и ядром хозяина.
Клеточные органеллы можно также переносить посредством липосом. Широкий спектр одно- и многоламелльных частиц, которые сливаются с мембранами протопластов, получен с применением таких веществ, как фосфатидилсерин, холистерол и т.д. Можно также переносить органеллы путем микроинъекций. Этот метод широко используется для введения в клетку ДНК, РНК, а недавно был успешно использован и для переноса клеточных органелл у растений.
Кроме ядра трансплантируют и другие органеллы, такие как митохондрии и хлоропласты. Выбор этих органелл объясняется их полуавтономностью, то есть наличием собственной ДНК и способность делиться самостоятельно, независимо от деления самой клетки. Кроме того, эти органеллы контролируют важнейшие физиологические процессы растительной клетки, такие как фотосинтез и дыхание. Например, перенос хлоропластов может использоваться для выведения новых форм хозяйственно важных сортов растений. Трансплантация высокоэффективных хлоропластов может способствовать активации фотосинтеза и повышению продуктивности растения.
Одним из важных моментов является сохранение клеточных органелл, поэтому для переноса их в последнее время используются субпротопласты – фрагменты, полученные из протопластов. Они могут содержать большую часть цитоплазмы, но без ядра (цитопласты), ядро с небольшим количеством цитоплазмы (кариопласты), часть хромосом с небольшим количеством цитоплазматического материала (микропротопласты).
Биологическое конструирование на уровне клетки может оказаться полезным и перспективным для создания клеток, клеточных систем и целых растений, удовлетворяющих потребности человека. Под биологическим конструированием следует понимать не только введение отдельных органелл. Аналогичным образом в клетку можно вводить и чужеродный генетический материал как в виде фрагментов ДНК, так и в виде отдельных хромосом. Кроме того, в изолированные протопласты можно вводить клетки микроорганизмов, создавая таким образом искусственные ассоциации.