Список сокращений
АБП – антибактериальный препарат
ДДМ – диско-диффузный метод
ДМСО – диметилсульфоксид
КОЕ – колониеобразующие единицы
МПК – минимальная подавляющая концентрация
BHI – Brain - heart infusion (сердечно-мозговой экстракт)
MHA – Mueller hinton agar (агар Мюллера-Хинтона)
Vкон – конечный объем
Введение
Определение чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний у человека - к антибактериальным препаратам (АБП) приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотико-резистентности у бактерий. Стандартным методом определения чувствительности микроорганизмов к АБП является диско-диффузионный метод (ДДМ), который был разработан во второй половине 60-х начале 70-х годов XX века.
Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит минимальную подавляющую концентрацию (МПК). МПК минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной питательной среде [Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents, 1998].
Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП позволяют решить следующие задачи:
- обоснование целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни отдельным пациентам [Leekha et al., 2011];
- осуществление наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах [Сидоренко, 2002];
- исследование новых химических соединений на наличие антибактериальной активности [Голубев и др.,2010].
В данной работе с помощью ДДМ проверяли наличие антибактериальной активности у 10 впервые синтезированных веществ. В качестве мишеней для веществ использовали два вида бактерий: Staphilococcus aureus ATCC 25923 и Pseudomonas aerugenosa 103.
Материалы и методы исследования
В экспериментах использовали:
Диски с антибиотиками для определения чувствительности к ним микроорганизмов (ФГУН НИИ ЭМ им. Пастера):
Расширенный набор дисков для оценки антибиотико-чувствительности синегнойной палочки и ацинетобактеров (набор №11), 11 антибиотиков;
Расширенный набор дисков для оценки антибиотико-чувствительности стафилококков (набор №14), 14 антибиотиков;
Диски без антибиотиков (пустые).
Реактивы: агар Мюллера-Хинтона (MHA среда, HiMedia), сердечно-мозговой экстракт (BHI среда, Becton Dickinson), фосфатно-солевой буфер (Sigma, США, таблетированная форма, pH7,4,).
Фосфатно-солевой буфер (Sigma, США),. Готовили из расчета 1 таблетка фосфатного буфера () на 200 мл дистиллированной воды.
Для приготовления твердых питательных сред использовали агар Мюллера-Хинтона (MHA среда,HiMedia). Среда подготавливалась в соответствии с инструкциями изготовителя из расчета 37 г на 1000 мл дистиллированной воды.
Сердечно-мозговой экстракт (BHI среда, Becton Dickinson) готовили из расчета 27 г на 1000 мл дистиллированной воды. Среда используется в качестве питательного бульона для выращивания ночной бактериальной культуры.
Все среды автоклавировали в течение часа (при давлении 1,2-1,3 мПА). MHA среду после автоклавирования охлаждали до 45-50С°, разливали по чашкам Петри высотой 3-4 мм и оставляли для застывания.
Культуры клеток микроорганизмов.
В работе использовали клинический изолят штамма ATCC 25923 Staphylococcus aureus (SA ATCC 25923) и штамма 103 Pseudomonas aeruginosa (PA 103) из коллекции микроорганизмов ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России.
S. aureus и P. aeruginosa инкубировали в течение 12 ч при 37°C в питательном бульоне Brain Heart Infusion («Difco», США), разводили в фосфатно-солевом буфере до достижения оптической плотности (D 625), равной 1 - это т.н. стандарт мутности 0,5 по Мак-Фарланду [Семина и др.,2004],что соответствует концентрации 1,5 ×108 КОЕ/мл.
Диско-диффузионный метод .
Активность АБП в ДДМ проверяют на бактериях, предварительно выращенных на твердых питательных средах. На поверхность агара в чашке Петри наносят бактериальную суспензию в концентрации 1,5 ×108 КОЕ/мл и затем помещают диски, содержащие определенное количество антибиотика. На одну чашку Петри диаметром 90 мм можно нанести не более 6 дисков на расстоянии 2 см друг от друга. Диффузия антибиотика с дисков в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. После инкубации чашек в термостате при температуре 37°С в течение ночи учитывают результат путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах, что позволяет оценить степень антибактериальной активности вещества.
Схематично ДДМ представлен на рисунках 1 и 2.
Рис.1. Схема диско-диффузного метода (ДДМ)
Рис.2. Варианты диаметров зон подавления роста бактерий