5.1. Изотонический раствор - 0,85% раствор хлористого натрия
Для приготовления изотонического раствора с рН 6,9-7,0 используют дистиллированную воду, рН которой проверяют индикатором бромтимолблау, при его добавлении цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных случаях воду не используют. Изотонический раствор разливают в пробирки или флаконы в необходимых количествах, стерилизуют при I атм. 20 мин.
5.2. 0,1%-й водный раствор пептона (пептонная вода)
К I л дистиллированной воды добавляют I г пептона. После размешивания среду кипятят, фильтруют и разливают по пробиркам и флаконам в необходимых количествах, стерилизуют при I атм. 30 мин.
5.3. Среда для определения общего количества мезофильных
аэробных в факультативно анаэробных микроорганизмов
Сухой питательный агар (ДагНИИПС) - 35,0 г
Сухой экстракт кормовых дрожжей - 2,5 г
Глюкоза - 1,0 г
Вода дистиллированная - 1000 мл
Довести рН до 7,0, разлить в пробирки по 15 мл, стерилизовать в течение 20 мин при 121°С (1,1 атм).
5.4. Среда Кесслер с лактозой
К I л водопроводной воды прибавляют 10 г пептона и 50 мл желчи крупного рогатого скота, кипятят смесь при помешивании 20-30 мин в водяной бане и фильтруют через вату. В полученном фильтрате растворяют 2,5 г лактозы и доводят объем до I л, устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6), после чего добавляют 2 мл 1% водного раствора кристаллического фиолетового, разливают в пробирки по 5,0 мл, 10,0 мл и во флаконы по 50 мл. Готовая среда должна иметь темно-фиолетовый цвет. Среду стерилизуют при I атм. 10 мин, предварительно опустив в пробирки поплавки.
5.5. Среда КОДА
Среду готовят по прописи на этикетке. Разливают по 5 и 10 мл в пробирки без поплавков.
5.6. Бульон с лактозой, бычьей желчью и бриллиантовым зеленымЖ Л Б
пептон - 10 г
лактоза - 10 г
сухая бычья желчь - 20 г (или 200 мл свежей
фильтрованной желчи кр.рог.скота)
бриллиантовый зеленый - 0,0133 г
дистиллированная вода - 1000 мл
Растворяют пептон и лактозу в 500 мл дистиллированной воды, добавляют бычью желчь, растворенную в 200 мл воды, смешивают, доводят объем до 950 мл, рН до 7,4. Добавляют 13,3 мл 0,1% водного раствора бриллиантового зеленого, доводят общий объем водой до I л. Разливают в пробирки с поплавками по 10 мл. Стерилизуют 15 мин при 121°С.
5.7. ЕС-бульон (для подтверждающего посева на Е.col по методу Н В.Ч)*
Сухой панкреатический гидролизат казеина - 20 г (или десяти-
кратное количество жидкого ПГК с содержанием ок.500мг%
аминного азота)
Желчь крупного рогатого скота жидкая - 15-16 мл
Лактоза - 5 г
К2НРО4 - 4 г
К Н2РО4 - 1,5 г
NаСl - 5 г
дистиллированная вода - 1000 мл
Растворяют ингредиенты, доводят рН до 6,9, разливают по 15 мл в пробирки с поплавками, стерилизуют в течение 15 мин при 121°С.
*) Пропись ФАВ/ВОЗ в модификации Института питания АМН СССР
5.8. Среда Гисса с глюкозой
На I л дистиллированной воды берется 10 г пептона, 5 г хлористого натрия, 2,5 г глюкозы. В дистиллированную воду в начале добавляют пептон, хлористый натрий и кипятят до растворения ингредиентов, затем добавляют 10 мл реактива Андреде. Устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют углевод и фильтруют. Среду разливают в стерильные пробирки с поплавками 2-8 мл. Стерилизуют при 0,5 атм. 20 мин.
Приготовление индикатора Андреде:
Фуксин кислый в количестве 1 г растворяют в 200 мл дистиллированной воды, добавляют 32 мл нормального раствора едкого натра. Полученную смесь настаивают в течение 3-х суток при комнатной температуре или в течение суток при 37оС, после чего фильтруют. Реактив хранят во флаконе с притертой пробкой.
5.9. Среды Эндо, Левина
Среды Эндо, Левина (возенметиленовоголубой агар) выпускается в сухом виде Дагестанским НИИ питательных сред, их следует готовить согласно прописям на этикетках банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре 4оС± 1оС до 10 суток.
5.10. Среда для определения индолообразования
Сухой панкреатический гидролизат казеина - 10 г
NaCl - 5 г
ДJ – триптофан - 1 г
дистиллированная вода - 1000 мл
5.11. Бульон на переваре Хоттингера для определения индолообразования
В случае отсутствия среды 6.10 используется для теста на индол.
Для приготовления бульона основной перевар Хоттингера разводят дистиллированной водой (или водопроводной) до содержания аминного азота 120-130 мг%, добавляют хлористый натрий в концентрации 0,5%, K2HPO4 – 0,1%. Устанавливают рН 7,4-7,6 и кипятят 15-20 мин. Приготовленный бульон фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 5-8 мл. Стерилизуют при 1 атм. 20 мин.
Индикаторная бумажка на индол
Спирт этиловый 960 — 50 мл
парадиметиламинобензальдегид — 2,5-3,0 г
фосфорная кислота (конц.) - 10 мл
Добавленные в спирт ингредиенты смывать до полного растворения. Полученной желтоватой жидкостью смочить край, приблизительно на 1/3 полоски фильтровальной бумаги. Цвет смоченного конца полоски бумаги должен быть желтым. При образовании индола изучаемой культурой цвет бумажки меняется от сиренево-розового до интенсивно-малинового.
5.12. Среда Кларка
Пептон - 5-7 г
Глюкоза - 5 г
К2НРО4 - 5 г
дистиллированная вода - 1000 мл
Растворить ингредиенты, довести рН до 6,9 и профильтровать
Стерилизовать 20 мин при 115°С.
5.13. Раствор метилового красного для теста с метил-рот
Растворить 0,1 г метилового красного в 300 мл 90% этилового спирта. Развести до 500 мл стерильной водой, хранить при Т +4°С.
5.14. Реактивы для реакции Фогеса-Проскауэра
5% альфа-нафтол: растворить 5 г альфа-нафтола в 100 мл абсолютного этилового спирта. Хранить при Т + 4°С.
40% КОН: растворить 40,0 г КОН (гранулы) приблизительно в 60 мл дистиллированной воды. Разбавить до 100 мл дистиллированной водой.
Хранить при Т +40С.
5.15. Цитратная среда Козера
Nа (NH4) НРО4- 1,5 г
К4НРО4 - I г
МgSO4 - 0,2 г
натрия цитрат трехзамещенный - 3 г
дистиллированная вода - 1000 мл
Растворить ингредиенты в 950 мл дистиллированной воды, добавить 10 мл 0,5% спиртового раствора бромтимолового синего. Установить pН 6,8, проверяя значение рН на потенциометре. Довести объем дистиллированной водой до 1 л. Рaзлить в пробирки по 10 мл, стерилизовать в течение 15 мин при 121°С.
5.16. Среда Симмонса
Среда готовится аналогично среде Козера (6.15.), но после измерения рН в нее добавляют 20 г ±0,1 г агар-агара на 1 л. Прогревают на водяной бане до растапливания агара, стерилизуют в течение 15 мин при 121°С. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.
5.17. Среда Ресселя с мочевиной из сухих питательных сред
К 100 мл горячей стерильной дистиллированной воды добавляют 4 г сухого препарата с индикатором ВР и лактозой, 0,1 г глюкозы в 1 г мочевины. Полученную среду разливают в стерильные пробирки по 5-6 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин., или текучим паром 2 дня подряд по 15-20 мин.
5.18. Тресахарный агар с мочевиной по Олькевицкому
К 100 мл стерильного питательного агара добавляют 1 г лактозы, 0,02 г соли Мopa, 0,3 г гипосульфита, I г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,4% раствора фенолового красного 0,4 мл. Предварительно растворяют соль Мopa с гипосульфитом в одной пробирке с небольшим количеством воды, а в другой - мочевину с углеводами. После растворения все смешивают с агаром и фильтруют через стерильную марлю. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Горячую среду сливают в пробирках. Незасеянная среда имеет бледно-розовый цвет.
5.19. Солевой бульон
К 100 мл МПБ с рН 7,0 добавляют 6,5 г хлористого натрия. Разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1 атм 20 мин.
5.20. Сахарный бульон
К 100 мл стерильного бульона Хоттингера с рН 7,2-7,4 и содержанием 130-150 мг%аминного азота, добавляют глюкозу в количестве 1,0 г. После растворения среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин.
5.21. Стерильное молоко
Стерильное молоко готовят из обезжиренного молока (кислотность 16-18°Т), которое разливают в пробирки по 10 мл. Стерилизуют при 0,75 атм 15 мин. Обезжиренное молоко получают путем центрифугирования или кипячения с последующим отстаиванием в цилиндре в холодильнике в течение 2-х дней.
5.22. Молочно-солевой агар
К 100 мл расплавленного и остуженного до 45°С 2% питательного агара с концентрацией 6,5% хлористого натрия добавляют в количестве 10 мл стерильное обезжиренное молоко. Среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам.
5.23. Желточно-солевой агар
Желточно-солевой агар может быть приготовлен па основе сухого питательного агара, мясо-пептонного бульона или бульона Хоттингера.
Прииспользовании МПБ к последнему добавляют 2% агар-агара и 6,5% хлористого натрия. При использовании бульона Хоттингера содержание аминного азота в нем должно составлять 150 мг%, для получения солевого агара добавляют 2%агар-агара и 6,5 % хлористого натрия.
В случае использования сухого питательного агара к последнему добавляют 6,5% хлористого натрия.
Солевой агар разливают во флаконы по 200 мл и стерилизуют при 1 атм 30 мин.
Приготовление рабочего раствора желтка:
На дно стерильной чашки помещают яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной спиртом. Пинцетом пробивают с двух противоположных сторон яйца 2 отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную банку с 5-6 бульонами. К желтку постепенно добавляют частями по 20-30 мл 180-200 мл стерильного изотонического раствора NaCl. Затем содержимое тщательно встряхивают.
Приготовление чашек:
На 100 мл расплавленного и остуженного до 45оС солевого агара добавляют 20 мл рабочего раствора желтка. После полного размешивания агар в условиях бокса разливают в чашки по 15-17 мл. Чашки можно хранить в холодильнике до 1,5-2 недель.
5.24. Молочный агар
К 100 мл 2%-ного расплавленного и остуженного до 45оС питательного агара добавляют 10 мл стерильного снятого молока. После тщательного перемешивания агар высыпают в чашки по 12-15 мл.
5.25. Цитратная плазма кролика
Цитратная плазма кролика для реакции плазмокоагуляции выпускается в сухом виде. Готовят непосредственно перед употреблением согласно прописи, прилагаемой в наставлении.
5.26. Среда для определения реакции окисления маннита в анаэробных условиях
Среду готовят из сухого препарата с индикатором ВР и маннитом по прописи на этикетке. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл.
5.27. Среда Плоскирева из сухих питательных сред
Среду готовят по прописи на этикетке.
5.28. Висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера)
Среду готовят по прописи на этикетке. Изготовленную и разлитую в стерильные чашки Петри среду можно хранить в холодильнике при +4оС до 10 суток.
5.29. Среда для определения ферментации мальтозы
Среду готовят из сухого препарата с индикатором ВР и мальтозой по прописи на этикетке. Среду разливают в пробирки по 2-3 мл.
6. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ВЫПУСКАЕМЫЕ В ГОТОВОМ ВИДЕ
| № п/п | Название среды | Заготовитель |
| Сухой питательный агар | ДагНИИПС (г.Махачкала) | |
| Сухой питательный бульон | - «- | |
| Агар Эндо | - «- | |
| Агар с возин-метиленовым синим (Левина) | - «- | |
| Висмуг-сульфит агар | - «- | |
| Бактоагар Плоскирева | - «- | |
| Препараты с индикатором ВР и сахарами: | - «- | |
| - с глюкозой | - «- | |
| - с лактозой | - «- | |
| - с мальтозой | - «- | |
| - с сахарозой | - «- | |
| - с многоатомным спиртом маннитом | - «- | |
| Среда КОДА | - «- | |
| Среда Клиглера | МНИИВС им.Мечникова (г.Ветрово-Дальнее, Московская область | |
| Солевой агар | - «- | |
| Бульон Хоттингера | ИЭМ им.Гамалеи АМН г.Москва | |
| Сухая цитратная плазма кролика | Белорусский ИЭМ, г.Минск |
7. НАТУРАЛЬНЫЕ ПРОДУКТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
1. Молоко коровье
2. Яйца куриные
8. СПЕЦИФИКАЦИЯ ПРИМЕНЯЕМЫХ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКТИВОВ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
| № | Техническое, фармацевтическое или торговое название материала | ГОСТ, ОСТ или статья фармакопеи | Квалификация | Примечание |
| Агар микробиологический | 17206-71 | Высший сорт | ||
| Бульон мясо-пептонный | 20730-75 | |||
| Бромтимоловый синий, инд. | ТУ 6-09-2086-72 | ч.д.е. | ||
| Вода дистиллированная стерильн. | 67-09-72 | |||
| Д-глюкоза | 6038-74 | х.ч. | ||
| Желчь крупного рогатого скота, сухая или нативная | ||||
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 2493-75 | х.ч. | ||
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | 4198-75 | х.ч. | ||
| Лактоза | 6038-74 | х.ч. | ||
| Маннит | 8321-74 | х.ч. | ||
| Магний сернокислый | 4523-67 | х.ч. | ||
| Магний хлористый | 4209-67 | х.ч. | ||
| Мочевина | 6691-67 | х.ч. | ||
| Метиловый красный | 5853-51 | х.ч. | ||
| Натрий едкий | 11078-71 | х.ч. | ||
| Натрий серноватокислый (тиосульфат) | 4215-66 | х.ч. | ||
| Натрий хлористый | 4233-77 | х.ч. | ||
| Натрий фосфорнокислый двузамещенный безводный | 11773-66 | х.ч. | ||
| Натрий фосфорнокислый однозамещенный безводный | 245-66 | х.ч. | ||
| Натрий лимоннокислый трехзамещенный безводный | 222-80-76 | х.ч. | ||
| Натрий -аммоний фосфорнокислый | 4170-68 | х.ч. | ||
| Натрий двууглекислый | 4201-66 | х.ч. | ||
| -нафтол | 5838-70 | х.ч. | ||
| Пептон ферментативный | 13805-76 | |||
| Спирт этиловый ректификованный | 5964-67 | 96о | ||
| Сахароза | 5833-75 | |||
| Реактивы для окраски по Граму | 18963-73 | |||
| Фосфорная кислота | 6552-58 | х.ч. | ||
| Фуксин кислый, инд. | ТУ 200254 | х.ч. | ||
| Феноловый красный | 4599-73 | х.ч. | ||