Собственные исследования

Содержание

 

Введение ……………………………………………………………................3

Обзор литературы …………………………………………………………… 5

Собственные исследования …………………………………………………14

Документы, которые регламентируют ход исследований ………………. 21

Заключение …………………………………………………………………..22

Список литературы ………………………………………………………….23

Приложение ………………………………………………………………….24

Введение

Бруцеллез – инфекционная, хронически протекающая болезнь. Выбор темы для курсовой работы обосновывается тем, что бруцеллез – заболевание, распространенное во всех странах мира. Им болеют не только животные, но и люди. Бруцеллез – самое распространенное зооантропонозное заболевание. Большинство людей заражаются бруцеллезом, употребляя продукты питания животного происхождения. Так, в Испании ежегодно заражаются бруцеллезом 100000 людей при потреблении молока и молочных продуктов. Бруцеллез – профессиональное заболевание ветеринарных врачей. Это связано с тем, что бруцеллы могут проникать в организм через неповрежденную кожу.

Следует отметить существенное снижение числа пунктов, не благополучных по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота за 1955 – 2002 гг. Но оздоровление неблагополучных пунктов завершить не удается.

Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ в 2002 году было отмечено резкое ухудшение эпизоотической обстановки по бруцеллезу крупного рогатого скота в отдельных субъектах РФ Северо-Кавказского региона. Основные причины:

1. При отгонно-пастбищном содержании допускаются контакты стада с различным эпизоотическим статусом, не всегда исследуется каждое животное.

2. Передержка в хозяйствах больных животных без изоляции.

3. Нарушение кратности проведения специальных диагностических исследований и схем применения вакцин при иммунизации животных.

4. Отсутствие необходимых финансовых и материально-технических средств для проведения оздоровительных мероприятий.

Бруцеллез мелкого рогатого скота с 2000 по 2002 годы регистрируют только на восьми административных территориях РФ. Самыми неблагополучными являются республика Дагестан, Тыва, Калмыкия, Ставропольский край, Астраханская область.

Причинами распространения и поддержания очагов бруцеллеза являются грубые нарушения при формировании отар, завоз овец из неблагополучных хо­зяйств, а также из Казахстана.

В республиках Дагестан и Тыва, в Ставропольском крае и Калмыкии заре­гистрирован бруцеллез у людей. В 2002 году заболело 230, 62, 64, 19 человек, соответственно.

Из других видов животных бруцеллез в 2002 году был зарегистрирован у оленей в четырех субъектах РФ: Ямало-Ненецкий АО — 8 неблагополучных пунктов, Таймырский АО — 7, Чукотский АО — 8, Республика Саха — 17.

Оздоровление этого вида животных затруднено из-за сложных условий для взятия крови и доставки ее в ветеринарную лабораторию, включения в эпизо­отический процесс диких животных (волков, медведей, оленей и других видов).

Обзор литературы

Историческая справка. Со времен открытия первого возбудителя из группы Brucella прошло более 80 лет. Возбудителя мальтийской лихорадки, получившего название Micrococcus melitensis, впервые выделил английский военный врач Брюс в 1887 г. из селезенки умершего от этой болезни солдата на о. Мальта.

Второй важной вехой в изучении заболевания явилось то, что Райт и Семпл открыли в 1897 г. специфическую агглютинацию культуры возбудителя мальтийской лихорадки сывороткой крови больных людей. Эта реакция, получившая название реак­ции Райта, является до настоящего времени одной из основных диагностических реакций бруцеллеза у сельскохозяйственных животных и человека.[9]

Возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота выделили из амниотической жидкости абортированного плода коровы в чистую культуру датские ветеринарные врачи Банг и Стрибольт в 1896 г. Возбудитель был назван Вас. abortus bovis. Через 16 лет, в 1912 г., американский ученый Траум обна­ружил возбудителя бруцеллеза в органах абортированного плода свиньи. Ввиду схожести выделенной культуры с возбудителем аборта коров Траум вначале отождествил его с Вас. abortus bovis, затем возбудитель стал называться по аналогии с возбудителем абортов у крупного рогатого скота Brucella suis.[1]

Начальную классификацию группы Brucella осуществила амери­канская исследовательница Ивенс в 1918 г. Она установила, что по морфологическим, некоторым биохимическим свойствам, а также по антигенной структуре оба возбудителя, т. е. Micrococcus melitensis и Вас. abortus bovis не отличаются друг от друга. Ее работы были подтверждены другими исследователями, и в 1920 г. Мейер и Фезье объединили двух указанных возбуди­телей в один вид Brucella, состоящий из двух типов: 1) Br. melitensis -var. melitensis; 2) Br. melitensis — var. abortus.

Эта классификация даже на тот период была недостаточной, так как в нее не был включен уже известный возбудитель бруцел­леза у свиней. Усовершенствование внес американский ученый Хеддлесон, который в 1929г. предложил следующую класси­фикацию:

1-й тип — Br. melitensis = Micrococcus melitensis;

2-й тип — Br. abortus = Вас. abortus bovis;

3-й тип — Br. suis = Вас. abortus suis.

Эта классификация оказалась стабильной. Ее принцип сохранился, до настоящего времени, так как видовое обозначение варианта возбу­дителя правильно отображает главную его сущность.

В дальнейшем вновь выявляемые представители рода Brucella обозначались именно по этому принципу. Так, в 1966 г. Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета по номенклатуре бактерии был включен в род Brucella новый, 4-й, вид Br. neotomae, вызывающий бруцеллез у крыс, обитающих изолированно от челове­ческого жилья в глухих лесах в Америке. Указанного возбудителя открыли Стоеннер и Лакман в 1957 г.

Затем в 1970 г. Подкомитетом по таксономии бруцелл было вклю­чено в род Brucella еще 2 вида бруцелл: 5-й вид — Br. ovis и 6-й -Br. canis. Кроме увеличения числа видов бруцелл, возросло также и количество биотипов, входящих в первые 3 вида бруцелл. Так, по современной (1970 г.) номенклатуре в группе Br. melitensis рассматривается 3 биотипа, в группе Br. abortus — 9 биотипов и в группе Br. suis — 5 биотипов.[9]

Морфология. Бруцеллы – грамотрицательные, неподвижные кокки, коккобактерии или короткие палочки размером 0,5–1,5 мкм. У свежевыделленых штаммов преобладают кокковидные клетки. Располагаются одиночно, реже парами, короткими цепочками или из нескольких клеток.[8] В зависимости от условий и времени культивирования, состава питательной среды, а также степени диссоциации клетки бруцелл могут иметь выраженные отклонения, иногда даже в одной колонии. Спор не образуют. Мукоидные и гладкие варианты синтезируют нежную капсулу. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. По Стампу, Козловскому и Шуляку-Шину окрашиваются в красный цвет. Другие микроорганизмы и фон препарата зеленого цвета. [2]

Культивирование. Бруцеллы могут расти на обычных питательных средах при 36…38ºС и рН 6,8…7,2, однако для их культивирования используют специальные среды: мясопептонный печеночный бульон (МППБ), мясопептонный печеночно-глюкозно-глицериновый бульон и агар (ПГГБ, ПГГА) с 1% глюкозы и 2…3 % глицерина, картофельный агар, сывороточно-декстрозный агар, агар Альбими, эритрит агар и др. При выделении бруцелл из загрязненного материала в среды добавляют генцианвиолет 1:100 – 250 тыс., малахитовый зеленый – 1:500 тыс., кристаллвиолет – 1:100 тыс. Для роста некоторых видов, особенно при первичном выделении из патологического материала, необходимо наличие в атмосфере СО2. Для выделения бруцелл посевы инкубируют в аэробных условиях в течение 30 суток и просматривают через каждые 3-4 суток. При первичном выделении рост на питательных средах обнаруживают на 14-15 сутки, тогда как лабораторные культуры дают рост через 1-2 суток. [5]

Вирулентные типичные штаммы (S-форма) на поверхности агара образуют мелкие, 2…3 мм в диаметре, круглые, выпуклые, с гладкой поверхностью и ровными краями, прозрачные с голубоватым оттенком колонии. В бульоне образуют слабое равномерное помутнение и пристеночное кольцо, в дальнейшем – небольшой осадок, который по мере старения культуры становится вязким и при встряхивании поднимается в виде косички.

Авирулентные варианты (R-форма) на агаре образуют шероховатые колонии, в бульоне – неравномерное помутнение с просветлением и крошковатым осадком. На агаре с кровью Бруцеллы гемолиза не дают, пигмент не синтезируют. [1]

Биохимические свойства. Сахаролитическа активность у бруцелл выражена слабо. Они утилизируют углеводы, но не образуют кислоту и газ в количествах, достаточных для их идентификации. Бруцеллы гидролизуют желатин и не свертывают молоко. Редуцируют нитраты, не образуют индола, не обладают гемолитическими свойствами. Реакция Фогес–Проскауера и с метиловым синим отрицательны. B. Abortus и особенно B. suis при росте выделяют сероводород; B. Melitensis образует его в незначительном количестве на средах с серосодержащими аминокислотами (см приложение, табл.1). Могут продуцировать каталазу, пероксидазу, липазу, фосфатазу. Некоторые виды гидролизуют аминокислоты с образованием аммиака.[7]

Антигенная структура.Бруцеллы в S-форме трех основных ви­дов обладают двумя соматическими антигенами: M (melitensis) и А (abortus). М-антигена у В. melitensis в 20 раз больше, чем у других видов, в небольшом количестве также имеется А-антиген; соотно­шение антигенов А и M у В. abortus составляет 20:1. В. suis содер­жит больше М-антигена, чем В. abortus. Предполагают, что эти антигены представлены сложным глюцидо-липидополипептидным комплексом. Они активно индуцируют синтез антител, выяв­ляемых в реакциях преципитации, агглютинации, РСК и других. Особенности антигенной структуры бруцелл позволяют получить моноспецифические А- и M-антисыворотки. Все виды и формы бруцелл имеют общий J-антиген. Кроме того, был об­наружен поверхностный L-антиген, сходный с Vi - антигеном саль­монелл. [4]

Помимо чисто серологических методов для изучения антигенной структуры бруцелл используются и др. методы, которые основываются на химическом анализе отдельных комплексов бактериальных клеток. Что касается О-соматического антигена бруцелл, то при исследовании его по методу Буавена этот антиген целиком удаляется вместе с осадком после обработки бруцелл трихлоруксусной кислотой и последующим центрифугированием и поэтому не подвергается изучению. [9]

Устойчивость. Бруцеллы малоустойчивы к действию различных физических и химических факторов. Агаровые культуры в запара-финированных пробирках сохраняются несколько недель, лиофильно высушенные — годами. Прямые солнечные лучи убивают их за 4,5 ч. В воде бруцеллы выживают и более 5 мес, в поверхнос­тном слое почвы — 40 сут, на глубине 5...8 см — до 3 мес, в навозе при медленном высушивании — до 120 сут, в моче коров — до 4 сут, в почве зимой — 4...5 сут, в высушенных плодных оболоч­ках— до 120 сут. В охлажденном молоке сохраняются 6...8 сут, в кислом молоке — 1...4, в масле — 40...60, в сырах — более 42, в брынзе (5... 11 %-й раствор поваренной соли) — 45...60, в заморо­женном мясе — свыше 320 сут, в засоленных шкурах — 2 мес, в шерсти — до 3...4 мес.

При температуре 60 °С бруцеллы погибают через 30 мин, при 80...85 °С — через 5 мин, при 100 °С — мгновенно. Пастеризацию молока проводят при 85...90 °С 30 мин. Дезинфицирующие растворы — 2%-й фенол, 1%-й креолин, 0,5%-й лизол, 1...2%-й формалин, 0,5...1%-й хлорамин, 1%-я со­ляная кислота, 3%-й гидроксид натрия, 5%-я хлорная известь уби­вают бруцелл в течение нескольких минут. [10]

Патогенность. Патогенное действие связано с образованием эн­дотоксинов, а также гиалуронидазы, каталазы, уреазы. Бруцеллы высокоинвазивны, могут проникать через неповрежденные слизи­стые покровы пищеварительного тракта, легких, глаз и кожу. Вос­приимчивы овцы, козы, крупный рогатый скот, буйволы, свиньи, лошади, мулы, верблюды, северные олени, собаки, кошки, многие дикие животные (лоси, косули, сайгаки и др.). Молодняк до поло­вой зрелости более устойчив. Каждый вид бруцелл поражает жи­вотных определенного вида. Но бруцеллы могут мигрировать, за­ражая животных других видов.[7]

В. melitensis. Возбудитель бруцеллеза овец и коз, Особо опасен для людей. Может поражать крупный рогатый скот, свиней и другие виды животных. Высевы из патматериала дают заметный рост через 2-3 нед. Культуры S-формы более вирулентны для морских свинок и мышей, чем S-формы В. abortus, и могут вызывать инфекцию с леталь­ным исходом. Культуры в R-форме авирулентны. Вид имеет 3 биовара.

В. abortus. Возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота. У маточного поголовья вызывает аборты, эндометриты, артриты. Вызыва­ет инфекцию у лошадей, овец, верблюдов, собак, а также у человека. Восприимчивы к экспериментальной инфекции морские свинки, кро­лики и белые мыши. R-формы авирулентны. При выделении культуры посевы инкубируют как в обычных усло­виях, так и в атмосфере с 10—15 % CO2. При росте образуется сероводо­род. Вид подразделяется на 9 биоваров.

В. suis. Возбудитель бруцеллеза свиней. Подразделяется на 4 био­вара. Для свиней патогенны 1, 2 и 3-й биовары, вызывающие аборты и эндометриты у свиноматок, эпидидимиты и орхиты у хряков. Биовар 2 патогенен для зайцев, а биовар 4 — для северных оленей. Штаммы биоваров, за исключением биовара 2, патогенны для чело­века и многих видов животных. Из лабораторных животных чувстви­тельны кролики, морские свинки и белые мыши (инфекция сопровож­дается гнойными поражениями или развитием спленомегалии и грануломатоза). Наиболее вирулентны штаммы 1-го и 3-го биоваров. У мор­ских свинок вызывают летальную инфекцию.

В. ovis. Возбудитель инфекционного эпидидимита баранов. У самок вызывает аборты и эндометриты. Известны штаммы, образующие R-колонии и не имеющие А- и М-антигенов. Дают перекрестные реакции с R-вариантами других видов бруцелл. Не лизируется фагом Тв. При пер­вичном выделении посевы инкубируют в атмосфере с 10-15% С0₂. К экспериментальному заражению восприимчивы козы, вызывает суб­клиническую инфекцию у крупного рогатого скота, морских свинок и белых мышей. При идентификации В. ovis исследуют кроличью сыворотку, полу­ченную на выделенную культуру, с овисным антигеном в РДСК.

В. canis. Возбудитель бруцеллеза собак. Вызывает эпидидимиты, ор­хиты, простатиты, а у самок - аборты и эндометриты, Не имеет А- и М-антигенов и образует только шероховатые и слизистые колонии. Дает перекрестные реакции с R-вариантами В. ovis. В бульоне вызывает помутнение, образует поверхностную пленку и слизистый осадок. На плотных средах формирует вязкие, липкие колонии. У морских свинок и мышей вызывает заболевание только при введении большой дозы культуры.

В. neоtomae. Возбудитель бруцеллеза пустынных древесных крыс. Не обладает патогенностью для домашних животных. Морских свинок и мышей можно заразить большой дозой культуры.[8]

Больные животные выделяют возбудителя с молоком, аборти­рованным плодом, околоплодной жидкостью, влагалищной сли­зью, мочой, калом.

У мышей после заражения иногда развивается септицемия, свинки абортируют, худеют, у них выпадают волосы, возникает генерализованная инфекция.

У многих животных через 1...2 года наступает самовыздо­ровление.[4]

Патогенез. Независимо от места внедрения в организм бруцеллы распространяются по лимфатическим путям и задерживаются в реги­онарных лимфатических узлах, где размножаются, затем проникают в кровяное русло и попадают в паренхиматозные органы. Бруцеллы — внутриклеточные паразиты, обитающие в клетках лимфоидно-макрофагальной системы. В местах их размножения образуются спе­цифические гранулемы. При обострении процесса бруцеллы из кле­ток вновь проникают в кровь, вызывая различной интенсивности бактериемию и рецидив. В результате гибели бруцелл происходит ос­вобождение эндотоксина, который обусловливает соответствующую симптоматику острого и хронического бруцеллеза.[7]

Плодные оболочки многих животных содержат эритриол — фактор роста для бруцелл. Этим можно объяснить особенно высокую восприимчивость к инфекции беременных животных.

В патогенезе бруцеллеза определенное значение имеют L-формы бруцелл, которые длительное время персистируют в организ­ме. При хроническом процессе от животных выделяли культуры бруцелл стабильных L-форм.[9]

Иммунитет и средства специфической профилактики. Противобруцеллезный иммунитет формируется медленно в две фазы: первая фаза — инфекционный, или нестерильный, иммуни­тет; вторая — постинфекционный, или стерильный, иммуни­тет. Нестерильный иммунитет обусловлен присутствием возбуди­теля в организме.

В сыворотке крови больных животных накапливаются вначале IgM, затем IgG, а также неполные (IgA и IgG) антитела. Роль ан­тител в механизме защиты при бруцеллезе неэффективна: присут­ствие их в организме не препятствует бактериемии. Но они имеют большое диагностическое значение. В первой фазе отмечается уг­нетение макрофагальной реакции и фагоциты не способны пере­варивать бруцелл, что и приводит к диссеминации возбудителя по всему организму.

Иммунитет при бруцеллезе клеточный и обеспечивается Т-системой лимфоцитов. Для бруцеллеза характерно развитие гипер­чувствительности замедленного типа (аллергия). Инфекционный иммунитет переходит в постинфекционный постепенно и сопро­вождается освобождением организма от возбудителя, в результате чего может наступить самовыздоровление.[7]

Для специфической профилактики бруцеллеза предложены живые вакцины. Применяют живую вакцину из штамма 19 В. abortus. Этот штамм выделил в 1923 г. Бук, в процессе десятилетнего пассирования культуры на картофельном агаре, т. е. был селекционирован иммуногенный мутант. Вакцинация профилактирует аборты и распространение бруцеллеза в стаде, однако со­провождается длительной серопозитивностью привитых живот­ных, что не вполне удовлетворяет практику.

У нас в стране кроме указанной вакцины широко применяют сухую живую вакцину из слабоагглютиногенного штамма 82 В. abortus против бруцеллеза крупного рогатого скота; живую вак­цину из штамма Рев-1 бруцелл вида мелитензис — против бруцеллеза мелкого рогатого скота. Во ВГНКИ разработана инактивированная адъювант-вакцина из штамма В. abortus KB 17/100, которая создает напряженный иммунитет у крупного рогатого скота, не обладает реактогенными и абортогенными свойствами, не вызывая при этом образования S-аглютининов у вакцинированных животных, что важно для серологической диагностики.[4]

 

 

Собственные исследования

В хозяйстве СПК «Боевик» абортировала корова в возрасте 3 лет. Ветеринарный врач, проведя внешний осмотр и выяснив с какой клинической картиной протекала болезнь поставил предварительный диагноз – бруцеллез. При этом для исследования в лабораторию с сопроводительным документом (приложение, табл.2) отправляем следующий патологический материал: абортированный плод с плодовыми оболочками – для бактериологического исследования и кровь от коровы – для серологического исследования. Плодные оболочки содержат эритриол – фактор роста для бруцелл, и бактерии в большом количестве заселяют их. Кровь берем для непосредственного обследования коровы. При обострении процесса бруцеллы из клеток лимфоидно-макрофагальной системы проникают в кровь, вызывая различной интенсивности бактериемию и рецидив, а также при гибели бруцелл эндотоксин проникает в ток крови. Лабораторные исследования проводим согласно схеме бактериологического исследования патологического материала на бруцеллез (приложение, таб.1)

В первый день исследований делаем 2 мазка из патологического материала – плодных оболочек, для этого:

1. Над пламенем обезжириваем стекло

2. В правую руку берем ножницы, в левую – пинцет. Прокаливаем над пламенем спиртовки.

3. Придерживая пинцетом патологический материал, отрезаем небольшой кусочек. Проводим несколько раз по стеклу.

4. Еще раз прокаливаем ножницы и пинцет для дезинфекции, ставим на место.

5. Когда мазок подсохнет, фиксируем его над пламенем спиртовки.

Первый мазок окрашиваем по Граму:

1. На фиксированный мазок помещаем полоску фильтровальной бумаги, пропитанную спиртовым раствором генциан кристалвиолета, наносим на нее несколько капель дистиллированной воды для увлажнения, выдерживаем 2 мин, бумажку удаляем.

2. Препарат, не промывая, обрабатываем раствором Люголя 2 мин, раствор сливаем.

3. Наносим 96% этанол на 45 с.

4. Препарат тщательно промываем водой

5. Окрашиваем фуксином Пфейффера 2 мин.

6. Вновь промываем водой, подсушиваем фильтровальной бумагой и микроскопируем.

Микроскопическая картина: кокковидные или палочковидные бактерии красного цвета – грамотрицательные.

Второй мазок окрашиваем по Козловскому:

1. Фиксированный на пламени мазок окрашиваем 2%-ным раствором сафранина.

2. Подогреваем до появления пузырьков, промываем водой

3. Докрашиваем 1 мин 1%-ным раствором малахитовой зелени, микроскопируем.

Микроскопическая картина: бруцеллы – ярко-красного, другие микроорганизмы – зеленого (или синего) цвета. Морфология увиденных микроорганизмов совпадает с исследованиями, которые провели ряд ученых при изучении бруцеллеза.

Для выделения чистой культуры готовим мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) и печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА).

Способ приготовления МППБ:

1. К 610 см³ мясной воды добавляем 305 см³ печеночного настоя, 10г пептона, 5 г натрия хлорида.

2. Кипятим 60 мин, водой доводим объем до первоначального.

3. Фильтруем, разливаем в пробирки, стерилизуем при 110 ºС 30 мин.

 

 

Способ приготовления ПГГА:

1. К 900 см³ печеночного настоя добавляем 9 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара.

2. Варим в автоклаве 60 мин при 110 ºС.

3. Фильтруем, устанавливаем рН 7.

4. Добавляем 20 г глюкозы и 25 см³ глицерина.

5. Разливаем в пробирки, стерилизуем при 110 ºС 30 мин.

Делаем посев микроорганизмов на МППБ:

1. Пробирку с патологическим материалом и пробирку с питательной средой держим в левой руке, в правую руку берем бактериологическую иглу и пробки от пробирок. Все манипуляции проводим над пламенем спиртовки.

2. Обжигаем края пробирок, бактериологическую петлю и вводим ее в пробирку с материалом, переносим материал в пробирку со стерильной питательной средой, стряхиваем с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель.

3. Края пробирок вновь проводим над пламенем горелки, закрываем пробирки пробками, стерилизуем петлю и ставим ее в штатив.

Делаем посев на ПГГА:

1. Пробирки с засеваемой культурой и питательной средой берем в левую руку, пробирку с ПГГА держим скошенной поверхностью среды вверх

2. В открытую у пламени пробирку с патологическим материалом вводим простерилизованную бактериологическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности материала и переносим его в пробирку со стерильной питательной средой.

3. Петлю опускаем до дна пробирки, погружаем в конденсированную жидкость и зигзагообразным движением проводим снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом»).

4. Пробирки закрываем пробками, петлю прожигаем.

Некоторые виды бруцелл растут при повышенном содержании в атмосфере оксида углерода (B. аbortus, B. оvis). Так как неизвестно, каким видом бруцелл заражен исследуемый материал, мы делаем посевы на МППБ и ПГГА в 2 экземплярах и половину посевов инкубируем в обычной атмосфере, другую – в атмосфере, содержащей 15% оксида углерода. Пробирки с посевами ставим в термостат при температуре 37ºС на 30 дней, периодически просматривая. На 30-е сут, исследуем чистые культуры. Рост наблюдаем на средах, инкубируемых как в обычных условиях, так и в атмосфере с 15% СО2. В МППБ видим равномерное помутнение, сформировалось пристеночное кольцо, небольшой осадок, который по мере старения культуры становится вязким и при встряхивании поднимается в виде косички. На ПГГА наблюдаем мелкие, выпуклые, гладкие блестящие, полупрозрачные с голубовато-серым оттенком колонии. Культуральные свойства схожи с описанными свойствами других авторов.

Затем делаем мазки из чистой культуры, окрашиваем по Граму, по Козловскому и микроскопируем: по Граму – кокковидные бактерии окрашиваются в красный цвет – грамотрицательные; по Козловскому – бруцеллы – красные, другие микроорганизмы – зеленые. Морфология увиденных микроорганизмов совпадает с описанием ряда авторов.

Следующим этапом наших исследований будет постановка биопробы – этот метод применяем для выделения из исследуемого материала возбудителя бруцеллеза, испытания патогенности бруцелл.

Для заражения используем морских свинок, т.к. они наиболее восприимчивы к искусственному заражению из подопытных животных и легко обследуются по РА.

Для заражения берем 2 здоровых морских свинок, не бывших под другими опытами и совершенно не реагирующих на бруцеллез. Для этого проводим РА. В начале приготавливаем сыворотку для исследования:

1. Берем кровь из вены у морской свинки при температуре не ниже 18ºС.

2. Оставляем ее при комнатной температуре на 2 – 3 часа. Спустя это время на поверхности образуется сгусток.

3. Делаем обводку: чистой спицей отделяем сгусток.

4. Ставим в холодильник на 6 – 7 часов. Сливаем.

5. Из присланной крови готовим сыворотку.

Делаем постановку РА:

1. Реакцию ставим в объеме 1 мл в чистых пробирках с ровным выпуклым дном в четырех разведениях: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80.

2. Используем антиген (взвесь культуры убитых бруцелл в физиологическом растворе), приготовляемый на биофабриках. Перед употреблением антиген тщательно встряхиваем

3. Для разведения испытуемой сыворотки расставляем в штативе 5 пробирок. В первой пробирке готовим основное разведение. Сыворотку берем в дозе 0,1 мл и добавляем к ней 0,9 мл физиологического раствора (разведение 1:10). Затем в третью, четвертую и пятую пробирки вливаем по 0,5 мл 5%-ного раствора поваренной соли. После этого из первой пробирки с основным разведением сыворотки во вторую и третью пробирки переносим по 0,5 мл разведенной сыворотки. В третьей пробирке сыворотку смешиваем с находящимся в ней физиологическим раствором и 0,5 мл этого разведения переносим в четвертую пробирку, где также смешиваем с физиологическим раствором и из этого разведения 0,5 мл переносят в пятую пробирку, из которой после смешивания с физиологическим раствором 0,5 мл удаляем. Затем в каждую пробирку (2,3,4 и 5) вносим по 0,5 мл антигена, разведенного в соотношении 1:10 физиологическим раствором. После внесения антигена в каждой пробирке будет по 1 мл смеси, соответствующей разведениям 1:10, 1:20, 1:40, и 1:80.

4. Одновременно с постановкой реакции с испытуемыми сыворотками ставим контрольные реакции: с негативной сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые; с позитивной сывороткой в разведении до ее предельного титра.

5. После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена пробирки тщательно встряхиваем и ставим в термостат при температуре 37ºС на 16 часов, а затем выдерживаем при комнатной температуре в течение часа.

6. Результаты реакции учитываем макроскопически, оцениваем в крестах. Для испытуемой сыворотки: + едва заметное просветление, слабо выражен «зонтик» и при встряхивании жидкости заметно небольшое количество хлопьев. Для негативной сыворотки: — просветление не наблюдается, «зонтика» нет, при встряхивании образуется равномерная взвесь. Для позитивной бруцеллезной сыворотки: + + + просветление не полное, «зонтик» выражен хорошо, при встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, жидкость остается частично прозрачной. Делаем вывод, что сыворотка морских свинок не содержит антитела к бруцеллезному антигену.

После того, как мы провели РА и убедились в отсутствии в сыворотке антител, проводим заражение морских свинок. Для этого используем исследуемый материал, который предварительно растираем в ступке со стерильным физиологическим раствором. После осаждения грубых частиц, путем 5 мин центрифугирования при 1000 об/мин, суспензию вводим подкожно в дозе 1 мл. Для этого:

1. Пальцами левой руки оттягиваем кожу, в образовавшийся «кармашек» - складку вводим иглу шприца, затем его содержимое.

2. Место заражения – с медиальной стороны бедра.

На 40-е сутки берем кровь и исследуем в РА в разведении от 1:10 до 1:80. Результаты РА: + + + просветление не полное, «зонтик» выражен хорошо, при встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, жидкость остается частично прозрачной. Делаем вывод, что в сыворотке морских свинок содержатся антитела к бруцеллезному антигену.

Следующим этапом будет серологическое исследование. Для этого используем присланную кровь от коровы, получаем из нее сыворотку и ставим пластинчатую роз-бенгал пробу (РБП):

1. Используем 2 обезжиренных стекла с лунками. На первое – контрольное стекло при помощи микропипетки наносим 0, 03 см³ позитивной бруцеллезной сыворотки. На второе стекло вносим 0,03 см³ исследуемой сыворотки.

2. На оба предметных стекла при помощи пипетки-капельницы вносим такое же количество, что и сыворотки, бруцеллезного антигена.

3. Тщательно смешиваем стеклянной палочкой до получения однородной смеси, распределяя по всей поверхности лунки.

4. Стекла покачиваем в течение 4 мин осторожными вращательными движениями.

5. Проводим учет реакции невооруженным глазом: на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой и антигеном в течение 4 мин появляются крупные хлопья розового цвета на белом фоне – мы убедились, что бруцеллезный антиген действует. На стекле с исследуемой сывороткой через 4 мин также появляются хлопья розового цвета на белом фоне - делаем вывод, что реакция положительная и в сыворотке крови от коровы содержатся антитела к известному бруцеллезному антигену.

Следующим этапом наших исследований проводим дифференциацию видов, для этого исследуем бруцеллы на образование сероводорода. На печеночный агар (рН 6,6) засеваем взвесь культуры в пробирку, под пробку которой закладываем бумажку, пропитанную раствором уксуснокислого свинца. Посев помещаем в термостат при 37 ºС. Бумажка потемнела, что свидетельствует об образовании сероводорода. Из табл.1 приложения, мы видим, что свойствами образовывать сероводород и способностью расти в условиях повышенного содержания углекислого газа, способны только

B. abortus.