Материалы и методы
Объектом исследования являлось собранное в ЮКО, Ордабасинском районерастения – Зайцегуб опьяняющий (LagochilusinebriansBunge) Видовая принадлежность была определена на основе результатов камеральных обработок собранного материала и таксономического анализа видов.
Получение фитоэкстракта
Фитоэкстракт дайындау үшін 10г ұсақталған өсімдіктің жерүсті бөлігіне 100 мл этонол (96˚C) құйылып, 3 күн қараңғы жерге қойылды. Кейін стерильді фильтр қағазымен сүзіліп алынып, 70˚C су моншасында 3 күн тиндализацияланды. Фитоэкстракттың тазалығы тексерілді.
Изучение антимикробной активности экстракта
Изучение антимикробной активности экстракта Зайцегубаопьяняющего(LagochilusinebriansBunge) проводилось методом диффузии в агар. В качестве тест-культур были взяты музейные и нами выделенные штаммы грамположительных бактерий видов Staphylococcus aureus, Bacillus cereus; грамотрицательных - Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. В качестве препаратов сравнения использовали аптечнуюромашку (цветы).
Тест культуры выращивали на жидкой среде при температуре от 30 до 37˚С в течение 18-20 часов. Культуры разводили 1:1000 в стерильной воде, вносили по 1 мл в чашки с соответствующими элективными питательными средамидля изучаемых тест-штаммов и засевали по методу «сплошного газона».
После на поверхносли агара формировали лунки размером 6 мм, в которые вносили исследуемые образцы экстракта, препараты сравнения и контроль. Контролем служило этиловый спирт. Посевы инкубировали при 37˚С, учет результатов проводили через 24 часа.
Антимикробную активность образцов определяли по диаметру зон задержки роста тест-штаммов (мм). Диаметр зон задержки роста меньше 10 мм и сплошной рост в чашке оценивали как отсутсвие антибактериальной активности, 10-15 мм – слабая активность, 15-20 мм – умеренно выраженная активность свыше 20 мм – выраженная активность. Каждый образец испытывался в трех параллельных опытах.
|
|
Изучение ранозаживляющей активности экстракта
Резаная рана
Для изучения влияния экстракта Зайцегубаопьяняющего(LagochilusinebriansBunge) на заживление гнойных ран у крыс в экспериментах invivoбыла использована раневая поверхность, экспериментально полученная в опытах с использованием 15 самцов беспородных белых крыс (вес 200-230г). Верхняя чать спины крыс обрабатывались 70˚C этанолом. Затем, на очищенном кожном покрове с левой и правой сторон вырезалась рана длиной – 2,5±0,5 см и глубиной – 4±0,1 мм с помощью медицинского скальпеля.
В течение эксперимента все животные содержались в одинаковых условиях виварного режима. Экспериментальные крысы были разделены на три группы (1 опытные и 2 контрольная, по 5 животных в каждой группе). В момент нанесения раны животные находились под общим эфирным наркозом.
Раны крыс с целью формирования искусственной гнойной среды заражали бактериальной суспензией (St. aureus) и после 48 часов рану обработали экстрактом зайцегуба опьяняющего. Раны животных первой группы обработали экстрактом зайцегуба опьяняющего, раны второй группы оброботали экстрактом ромашкой для сравнения (контроль 1), третья группа (контроль 2) нелеченные животные.
Для лечения гнойных ран у крыс этой группы применяли следующую тактику: гнойные раны животных обработали экстрактами растении, процедуру по отбиранию проб производили 1 раз в 2 дня. Забор материала данной серии на исследования осуществляли на вторые, четвертые, восьмые, двенадцатые и шестнадцатые дни с момента начала лечения.
|
|
Термический ожог
Биологические эксперименты проводили на беспородных белых крысах в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755) Животных содержали в условиях вивария на стандартном пищевом рационе при свободном доступе к воде и естественном освещении. Экспериментальный термический ожог кожи производили в аналогичных условиях прижиганием металлическим шпателем, предварительно нагретым в верхней зоне пламени спиртовки, температура которой, согласно техническим параметрам, указанным изготовителем, составляет 900°С (Технобиоэн, Москва), в течение 40 с. Одинаковое положение шпателя в пламени и время прогрева перед моделированием каждого ожога обеспечивали одинаковую глубину повреждения тканей. Затем в 4 точках обожженного участка, а также резаной раны внутрикожно вводили 24-часовую культуру Staphylococcusaureus в дозе 1010 КОЕ/мл в объеме 0,1 мл. Контрольной группе животных раны обрабатывали 1 раз в 2 сутки, в течение 20 дней 1 мл физиологического раствора, закрывали стерильной салфеткой и фиксировали лейкопластырем. Опытным животным аналогичным способом рану обработали экстрактом растении. Динамику заживления ран учитывали визуально, начиная со 2-го дня, на основании размера и глубины, состояния краев, стенок и дна раны, наличия и вида некротических тканей, площади неэпителизированной поверхности раны в мм2.
|
|
Определение органических соединений в растительном экстракте
Пробу анализировали с помощью газового хроматографа (ГХ) AgilentTechnology 6890 с масс-спектрометрическим (MC) детектором 5973 при таких параметрах: колонка кварцевая, капиллярная DB-35MS, длиной 30м, внутренний диаметр — 0.25мм толщиной пленки 0.25 мкм, температура термостата программировалась от 50°С до 300°С со скоростью 10°С/мин, температура инжектора - 250°С. Режим детектирования – мониторинг ионов в диапазоне m/z 34 до 550. Идентификация веществ проводилась на основе сравнения полученных мас-спектров с данными библиотеки NIST05-WILEY.
Статистическую обработку проводили методами параметрической статистики с вычислением средней арифметической и стандартной ошибки.
Результаты исследования антимикробной активности образцов приведены в таблице 1
Таблица 1
Антимикробная активность экстракта L.inebrians
| Исследуемый экстракт | Ингибирование роста, мм | |||
| S. aureus | B. cereus | E. coli | P.aeruginosa | |
| Lagochilusinebrians (цветы и листья) | 12±0,53 | 7±0,12 | 10±0,75 | 7±0,48 |
| Matricaria recutita L. (цветы) | 4,1±0,16 | 1,5±0,14 | 3±0,11 | 1,7±0,23 |
Жидкий экстракт зайцегуба опьяняющего (L.inebrians) обладает выраженной активностью в отношений всех грамположительных и грамотрицательных видов бактерии по сравнению с экстрактами цветов ромашки (Matricaria recutita L.)
Динамика процесса заживления кожной раны контролировалась измерением объема кожи, оценивали общее состояние животных, сроки появления грануляционной ткани, подсчет количества микроорганизмов из кожного покрова. Состояние раневой поверхности ежедневно фиксировали на цифровую фотокамеру и определяли ее площадь. Критерием для завершения лечения во всех случаях служила эпителизация раневой поверхности и покрытие ее шерстью. Полученные результаты исследования сравнили по группам.
Микробиологическую картину раневого процесса оценивали на 4 сутки от начала нанесения раны на 8, 12, 16. Проводили посев с раны на селективные среды. Подсчет количества выросших микроорганизмов проводили по таблице в колонеобразующих единицах на 1 мл раневого отделяемого (КОЕ/мл).
Таблица 2
| Группа животных | Количественное содержание микрофлоры в гнойной ране, КОЕ | |||
| Экстракт L. inebrians | 5,7×104 | 6х103 | 0.4х102 | |
| Экстракт Matricaria recutita L. (контроль 1) | 1,2×105 | 3×104 | 3.2×103 | 0,8×101 |
| Не леченные животные (контроль 2) | 1×104 | 1×105 | 2,4×104 | 0,4×103 |
На восьмые сутки от начала лечения экстрактом, выделенным из листьеви цветков зайцегуба опьяняющего, высев штамма S. aureus с раневой поверхности, наблюдается меньше по сравнению с контролями. На шестнадцатые сутки не наблюдается высев микроорганизмов, что подтверждает антимикробные свойства данного экстракта.
На протяжении всего периода лечения проводили ежедневный замер раны до окончания эксперимента. На четвертый день после заражения ран S. aureus, размеры ран увеличились и составили более 120% от первоначальных размеров. После санации раневой поверхности размер ран стал уменьшаться во всех исследуемых группах. Однако полученные нами данные свидетельствуют о значительном уменьшении площади раны именно в группе, пролеченный экстрактом, выделенным из листьев ицветков зайцегуба опьяняющегона 10 день. И уже на 14 день наблюдалось полное закрытие раневого дефекта, в области раны сформировался рубец, а в контрольной группе к 12 суткам только началосьснижение площади раны. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Динамика изменения площади ран в исследуемых группах от начала нанесения и заражения раны.
| Группа животных | |||||
| Экстракт Сatalpaspeciosa(листья) | 
| 
| 
| 
| 
|
| Экстракт Matricaria recutita L. (контроль 1) | 
| 
| 
| 
| 
|
| не леченные животные (контроль 2) | 
| 
| 
| 
| 
|
Таким образом экстракт, ранозаживляющее действие предлагаемой экстракта превосходит действие экстракта сравнения Matricaria recutita L. По результатом данного эксперимента установлено, что выделенный из листьев и цветков L.inebrians экстракт обладает наилучшим ранозаживляющим действием.
Далее мы исследовали терапевтическую эффективность фосфомицина при эксперименталь- ной инфицированной термической ране. У всех животных через 24 ч после термического воз- действия кожа в области ожога была уплотнена, отечна, в центре ожога отмечалось нарушение целостности кожных покровов, сукровичное отделяемое; края ожоговой раны были четко отграничены от окружающей здоровой кожи. Начиная с 3 суток эксперимента в центре ожога отмечалось скопление некротических масс. Динамика изменения площади раны под действием различных экстрактов представлена на рисунке.
Установлено, что полная эпителизация ожоговой раны у животных под действием экстракта L.inebriansпроисходила на 20 сутки, при терапии экстрактом Matricaria recutita L. на 24 сутки, в контроле на 28 сутки. Следовательно, обработка экспериаентальной инфицированной термической раны с экстрактом L.inebriansприводит к ускорению репарации таканевого дефекта по сравнению с контрольными значениями.
Результаты определения веществ спиртовых экстрактов листьев абрикоса приведены в таблице.
| № | Время удерживания, мин | Соединения | Вероятность идентификации, % | Процентное содержание, % |
| 8.652 | Фенол | 0,06 | ||
| 10.074 | Бензиловый спирт | 0,08 | ||
| 14.894 | Eugenol | 0,17 | ||
| 31.225 | O-метил-δ-токоферола | 0,10 | ||
| 32.282 | Витамин Е | 2,85 | ||
| 35.380 | стигмастерин | 0,90 | ||
| 36.635 | γ-ситостерол | 11,68 |
Всего в экстракте из листьев и цветков Lagochilusinebriansбыло идентифицировано 73 органических соединении. Из них выявлено что обладает антимикробной активностью, В значительных количествах в экстрактах из листьев и цветков содержался эвгенол [], фенол, бензиловый спирт обладающий антимикробной активностью,O-метил-δ-токоферола, витамин Е обладающий антиоксидантной и противовоспалительной активностью и γ-ситостерол обладающий антиатерогенной активностью.
1. У.Н. Зайнутдинов, Д.Н. Далимов, А.Д. Матчанов, А.Х. Исламов, Р.Т. Тлегенов**, Н.Х. Бозорова, Ф.А. Собирова СРАВНИТЕЛЬНОЕИЗУЧЕНИЕДИКОРАСТУЩЕЙИКУЛЬТУРНОЙФОРМ LAGOCHILUSINEBRIANS ХИМИЯРАСТИТЕЛЬНОГОСЫРЬЯ. 2011. №2. С. 189–190.