Отбор проб для химического анализа выполняется также, как для исследования физико-механических свойств почвы. Выбирают две площадки по 25 м2 каждая, из которых одну вблизи источника загрязнения, а другую - вдали от него. Площадки разбивают на квадраты в 1 м2. Пробы почвы отбирают по диагонали буром Некрасова, почвенным буром Френкеля, щупом конструкции В.А. Рождественского (рис. 2). Пробы почвы (5-8, массой до 1 кг каждая) отбирают в сухую погоду на глубине 0,25; 0,75-1, 1,75-2 м. При этом для каждого горизонтального слоя берут отдельно средний образец. Помещают пробы в полиэтиленовый мешок, который нумеруют и снабжают сопроводительным документом.
В лаборатории образцы почвы в зависимости от целей исследования анализируют в натуральном виде или в воздушно-сухом состоянии после высушивания в хорошо вентилируемом помещении. Пробы почвы исследуют сразу же после поступления в лабораторию или консервируют их при 0 0С толуолом или хлороформом. В таком состоянии пробы можно хранить в течение нескольких суток.
От химического состава почвы зависит качество произрастающей на ней растительности. Многие болезни животных возникают в связи с недостатком или отсутствием в почве минеральных солей и микроэлементов.
В почве постоянно идут сложные химические процессы разложения - перехода органических веществ в минеральные (минерализация). Это, естественно, влечет за собой освобождение (самоочищение) почвы от загрязнений продуктами жизнедеятельности человека, выделениями животных, сточными водами.
Для установления степени самоочищения и минерализации почвы определяют содержание в ней аммиака, нитритов, нитратов, хлоридов, окисляемость водной вытяжки. Под воздействием воды большинство из образующихся минеральных солей легко растворяется и переходит в водную вытяжку, в которой их определяют соответствующими методами.
Приготовление водной вытяжки из почвы. В колбу помещают 50 г свежей исследуемой почвы и добавляют 250 мл бидистилированной воды. В течение 3-5 минут содержимое колбы взбалтывают. Для осветления жидкости в колбу вносят 1 мл 13%-ного раствора сернокислого аммония и вновь взбалтывают в течение 30 с. Если жидкость не осветлилась, в колбу прибавляют 0,5 мл 7%-ного раствора гидроксида калия и взбалтывают. Содержимое колбы фильтруют. Если полученный фильтрат (вытяжка из почвы) оказался окрашенным, использовать его для исследования на наличие азотсодержащих веществ и хлоридов нельзя, его дополнительно обрабатывают вышеуказанными растворами сернокислого аммония и гидрооксида калия до полного обесцвечивания.
Определение наличия аммиака. Навеску исследуемой почвы массой 5 г помещают в пробирку, доливают 15 мл 1%-ного раствора хлорида калия, встряхивают в течение 3-5 мин., дают отстояться и фильтруют. В чистую пробирку наливают фильтрат, добавляют 2-3 капли реактива Несслера. Появление желтого окрашивания указывает на наличие аммиака в почве. Количество аммиака определяют колориметрически.
Определение наличия нитритов. В пробирку помещают навеску исследуемой почвы (5-10 г) и наливают 15-20 мл дистиллированной воды, встряхивают содержимое в течение 3-5 мин., дают отстояться и фильтруют. В чистую пробирку наливают 10 мл фильтрата добавляют 1 мл реактива Грисса, помещают на 15 мин. в водяную баню при температуре 70 0С. При наличии азотистой кислоты или ее соединений в зависимости от ее количества вытяжка окрасится в розовый или красный цвет. Количество нитритов определяют колориметрически по той же методике, которую используют для определения нитритов в воде.
Определение нитратов основано на взаимодействии дефиниламина с солями азотной кислоты (в присутствии серной кислоты образуется дифенилнитрозамин). В фарфоровую чашку наливают 1-2 мл водной вытяжки почвы, добавляют несколько кристалликов дифениламина и несколько капель концентрированной серной кислоты. О наличии нитратов свидетельствует темно-синее окрашивание. Количество нитратов определяют с помощью сульфофенолового раствора калориметрически.
Определение хлоридов. В пробирку наливают 10 мл водной вытяжки почвы и несколько капель раствора азотнокислого серебра. Появление белого хлопъевидного осадка указывает на наличие хлоридов.
В настоящее время нет строго принятых и установленных химических показателей для санитарной оценки загрязнения почвы. И в каждом отдельном случае необходимо подходить с большой осторожностью к оценке результатов исследования.
Почвы различных местностей будут различаться по своему составу. Например, незагрязненные черноземные почвы содержат такое количество органического азота и углерода, которое для других почв, например, подзолистой зоны, являются показателями загрязнения. Во всех случаях при анализе почвы на загрязнение органическими веществами для контроля необходимо параллельное исследование подобных же почв, но заведомо чистых незагрязненных.
Химическими показателями хода процесса разложения (минерализации) органических веществ, а следовательно, способности почвы к самоочищению, является аммиак (поглощенный аммоний) и отчасти нитраты. Последние - менее надежный показатель, чем аммиак, т.к. нитраты, с одной стороны, потребляются растениями, а с другой - быстро вымываются из почвы. Соли аммония напротив: хорошо поглощаются почвой, прочно и надолго удерживаются в верхних слоях ее (до 60-80 см глубины). В холодное время года процессы аммонификации и нитрификации в почве могут задерживаться или полностью приостанавливаться вследствие прекращения деятельности микробов под влиянием низкой температуры. В этих условиях в почвенной вытяжке может не оказаться аммиака и нитратов, несмотря на загрязнение почвы.
При исследовании почвы на содержание в ней аммиака и нитратов необходимо учитывать происхождение этих веществ, т.к. они часто вносятся в почву в виде минеральных удобрений. Санитарно-гигиеническое значение имеет только содержание в почве аммиака и нитратов из органических веществ в виде навоза, фекалий, трупов, сточных вод и пр.
О характере химических процессов в почве и ее санитарном состоянии можно судить и по содержанию кислорода и углекислоты в почвенном воздухе. Наличие в последнем метана, водорода, аммиака, сероводорода указывает на «пресыщение» почвы органическими веществами и продуктами их распада и в связи с этим - на существование в ней анаэробных условий.
Давность загрязнения почвы органическими веществами, степень и активность их разложения можно оценить по данным анализа этих процессов:
аммиак - загрязнение свежее;
аммиак, хлориды - загрязнение произошло недавно;
аммиак, хлориды, нитриты - процесс разложения органических веществ в разгаре;
аммиак, хлориды, нитриты, - с момента загрязнения прошел некоторый срок, но имеется и свежее загрязнение;
хлориды, нитриты, нитраты - свежего загрязнения нет, идет минерализация органических веществ
нитриты, нитраты - с момента загрязнения прошел большой срок;
нитраты - полная минерализация органических веществ.
Присутствие в почве нитратов свидетельствует о бывшем загрязнении ее органическими веществами. Хлориды также служат показателем давности загрязнения почвы по той причине, что они слабо удерживаются в ней и постепенно вымываются из верхних слоев в нижние. Таким образом, исследуя почву послойно, через каждые 20 см на глубину 1 м можно по количеству хлоридов в этих слоях (от 0-20 см, 20-40 см и т.д.) судить о давности ее загрязнения: в первые 3-4 месяца после загрязнения максимальное количество хлоридов находится в слое 0-20 см, позже максимум ее перемещается в нижележащие слои почвы.
Определение потребности почвы в извести
Признаками недостатка в почве солей кальция может в известной степени служить произрастание на ней таких растений, как едкий лютик, щавелек, хвощ, мхи, осоки и отсутствие или плохой рост бобовых - клевера, люцерны и др. На кислую реакцию почвы, а, следовательно, на необходимость ее известкования, часто указывает наличие ржавой окраски и радужных пятен в находящихся на этой почве мелких водоемов (болота, лужи, канавы).
Так как, кальций находится в почве, главным образом в виде карбонатов и бикарбонатов, ориентировочным методом определения последних может служить следующая проба. 5 г почвы смачивают 3-5 каплями 10%-ной соляной кислоты и наблюдают, произойдет ли вскипание (от выделения диоксида углерода). Отсутствие вскипания указывает, что карбонатов в почве нет или их очень мало - не более 1%; при слабом кратковременном вскипании - 3-4% и при сильном продолжительном - выше 5%. Кальция мало в легких песчаных, моховых, торфяных и северных минеральных почвах.
Более точное, хотя и косвенное определение потребности почвы в кальции и в известковании, производится путем установления рН водной (или солевой) вытяжки из почвы. Для получения водной (или солевой) вытяжки к 20 г почвы в колбу нужно добавлять 50 мл дистиллированной воды (или 1,0 н. раствора хлористого калия - 74,56 г КCl на 1 л дистиллированной воды), взбалтывать смесь в течение 3-5 мин. После чего дать ей отстояться или пропустить через плотный бумажный фильтр, чтобы получить прозрачную вытяжку.
Если рН водной (или солевой) вытяжки меньше 5, почва нуждается в известковании (бедна кальцием); рН от 5 до 6 указывает на среднюю степень потребности в известковании; при рН равном 6 и более, можно считать почву достаточно обеспеченной кальцием (нет необходимости в известковании).
Качественное определение мочи и экскрементов
Для определения в почве мочи 100 мл водной вытяжки помещают в фарфоровую чашку и выпаривают досуха. Остаток с небольшим количеством углекислого натрия нагревают, растворяют в воде и отфильтровывают. Фильтрат сгущают в фарфоровой чашке, добавляют несколько капель азотной кислоты и выпаривают досуха. Если в исследуемой почве содержится моча, то сухой остаток приобретает красно-желтую окраску, которая изменяется от добавления аммиака в пурпуровую, а от гидрооксида натрия - в сине-фиолетовую.
Для обнаружения экскрементов в почве к 250 мл водной вытяжки добавляют 0,3 г виннокаменной кислоты и выпаривают досуха. К остатку добавляют винный спирт и полученную спиртовую вытяжку также выпаривают досуха. К полученному сухому остатку добавляют небольшое количество раствора гидроокиси калия и исследуют запах: при фекальном загрязнении почвы обнаруживают присущий экскрементам специфический запах.
Санитарная оценка почвы на основании данных химического анализа иногда бывает затруднительна вследствие большой вариабельности химического состава так называемой чистой (незагрязненной) почвы. Поэтому в практике часто пользуются санитарным числом - показателем степени загрязнения и завершенности процессов самоочищения почвы.
Санитарным числом называется отношение количества почвенного белкового азота (азота гумуса) к количеству органического азота:
С = В/А,
где С - санитарное число; В - количество почвенно-белкового азота на 100 г абсолютно сухой почвы (мг); А - количество органического азота на 100 г абсолютно сухой почвы (мг).
Чем ближе к единице санитарное число, тем чище почва (табл.1).
. Санитарно-биологические методы исследования почвы
Бактериологическое исследование почвы
Пробы почвы для бактериологического анализа отбирают не менее чем с двух участков площадью 25 м2, причем один из них должен находиться вблизи источников загрязнения. Для составления средней пробы на каждом участке почву берут в 5 точках по диагонали или в пяти точках, расположенных конвертом, с глубины до 20 см стерильным инструментом (маленькая лопатка или совок).
Таблица 1
Показатели санитарного состояния почвы*
| Степень опасности | Степень загрязнения | Показатели эпизоотологической безопасности | Показатели загрязнения | Показатель самоочищения почвы: титр термофилов, г | |||||
| Общее число бактерий в 1 г почвы | Колититр, г | Титр анаэробов, г | Число яиц гельминтов в 1 кг почвы | Санитарное число | Химическими веществами (кратность превышения ПДК) | Радиоактивными веществами (кратность превышения естественного фона) | |||
| Безопасная | Чистая | Менее 1000 | ≥ 1,0 | ≥ 0,1 | 0,98 - 1,0 | ≤ 1 | ≤ 1 | 0,01-0,001 | |
| Относительно безопасная | Слабо загрязненная | Десятки тысяч | 1,0-0,01 | 0,1-0,001 | До 10 | 0,86-0,97 | До 10 | 1-1,5 | 0,001-0,00002 |
| Опасная | Загрязненная | Сотни тысяч | 0,01-0,001 | 0,001-0,0001 | 11-100 | 0,7-0,86 | 10-100 | 1,5-3 | 0,00002-0,00001 |
| Чрезвычайно опасная | Сильно загрязненная | миллионы | <0,001 | <0,0001 | >100 | <0,7 | >100 | >3 | <0,00001 |
* - при условии отбора проб почвы с глубины 0-20 см.
химический бактериологический энтомологический почва
Пробы почвы из более глубоко залегающих слоев (0,75 - 2 м) следует брать буром. При отсутствии бура выкапывают яму необходимой глубины и стерильным совком отбирают пробы с каждого горизонта, начиная с нижнего.
Для исследования почвы полей орошения и огородов пробы берут на глубине нахождения в ней корнеплодов (30 см). Среднюю пробу составляют из трех отдельно взятых с каждой гряды проб.
При изучении влияния почвы на санитарное состояние подземных вод и водоемов пробы следует брать с глубины 0,75 - 2 м. На кладбищах и скотомогильниках пробы берут с глубины 25 см и ниже глубины захоронения, а на участках для обеззараживания хозяйственно-бытовых отбросов - с глубины 25, 100 и 150 см.
Пробу почвы (200-300 г) помещают в стерильную банку и накрывают слоем ваты. Горлышко банки обертывают бумагой и перевязывают. На банку ставят номер и наклеивают записку, в которой указывают необходимые данные (дату, место отбора пробы). Если проб несколько, банки с почвой укладывают в деревянный ящик с гнездами и отправляют в лабораторию.
В лаборатории почву освобождают от щебня, стекла, корней и т.п., после чего просеивают через стерильные сита с отверстиями диаметром 3 мм. Затем образец почвы перемешивают и из него отбирают 30 г для разведения. Если невозможно, провести бактериологические исследования в день отбора почвы, допускается ее хранение не более 24 ч при температуре 1-2 0С.
При полном санитарно-бактериологическом анализе исследование почвы включает определение следующих показателей:
4. общее число сапрофитных бактерий (микробное число);
5. число бактерий группы кишечной палочки;
6. количество анаэробов (Cl. Perfringens);
7. количество термофильных микроорганизмов, определяющих характер загрязнения (навоз, фекалии, сточные воды).
С санитарной точки зрения имеет значение не только общее количество микробов, в том числе анаэробов, в почве, хотя оно обычно и соответствует содержанию органических веществ в ней, но и качественный (видовой) их состав.
Важную роль в отдельных случаях может играть исследование почвы на присутствие в ней возбудителей сибирской язвы, эмфизематозного карбункула, столбняка, злокачественного отека, паратифозных бактерий и т.д.
Подготовка пробы для анализа
г почвы помещают в стерильную колбу, куда добавляют 270 мл стерильного физиологического раствора. После этого содержимое тщательно взбалтывают в течение 10 минут, отстаивают 2-5 минут, а затем из полученной суспензии делают ряд разведений на стерильном физиологическом растворе, начиная от 1:10 до 1:1 000 000 в зависимости от загрязнения почвы.
Определение общего числа микроорганизмов
Исследуемую суспензию почвы в различных разведениях в объеме 0,1 мл стерильной пипеткой вносят в чашку Петри с агаровой питательной средой (Эндо, Плоскирева и др.). Чашки с посевом ставят в термостат при температуре 37 ± 1 0С на 24 часа, после чего выросшие колонии подсчитывают обычным способом и результат выражают на 1 г почвы.
Для характеристики санитарного состояния почвы особую ценность имеет установление коли-титра водной вытяжки почвы, поскольку наиболее частым источником заражения ее служат фекалии животных и людей, с которыми в почву может попадать различная патогенная микрофлора.
Под коли-титром подразумевают наименьшее количество посевного материала, при внесении которого в питательную среду наблюдается развитие бактерий кишечной группы.
Коли-индекс - количество бактерий кишечной палочки, приходящиеся на 1 г почвы.
Определение титра анаэробов (Cl. Perfringens) производится путем 9-кратных разведений основной почвенной суспензии. Из каждого разведения берут стерильной пипеткой по 1 мл и заливают в пробирки с молоком, разлитым по 5 мл. Для освобождения от неспороносной микрофлоры все посевы с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане при 800С (лучше при 430С) в течение 18020 часов. Наличие Cl. Perfringens регистрируется по наступившему характерному свертыванию молока с полным отделением сыворотки и выбрасыванию губчатого сгустка на поверхности благодаря энергичному газообразованию. Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний Cl. Perfringens, показывает титр этого анаэроба в почве.
Присутствие Cl. Perfringens подтверждается микроскопически нахождением в мазках из содержимого пробирок.
Сопоставление коли-титра и количества хлоридов в загрязненной фекалиями почве указывает на близкое соответствие этих показателей. Такое же соотношение существует между наличием в почве анаэробов и содержанием в ней аммиака. Следовательно, бактериологические показатели, с одной стороны, и указанные химические показатели фекального загрязнения почвы, с другой, соответствует друг другу.
В почве определяют также титр термофилов. Термофильная сапрофитная микрофлора не свойственна биологически чистым почвам и попадает в них с навозом и компостами.
Гельминтологические исследования почвы
Обнаружение в почве яиц гельминтов свидетельствует о загрязнении этой среды фекалиями человека и животных. Наибольшую эпизоотологическую опасность представляют яйца гельминтов и биогельминтов (аскариды, острицы, власоглавы, членики ленточных гельминтов), развитие которых до личиночной стадии протекает при благоприятном температурно-влажностном режиме в почве.
Для гельминтологического исследования пробы почвы отбирают на участках возможного загрязнения фекалиями с глубины 2-3 см, а на вспаханных почвах - до 25 см в зависимости от выращиваемых культур. На исследуемом участке в 9-10 точках пробы (200 г) берут с поверхности почвы шпателем или лопаточкой, а из глубоких слоев - лопаткой или буром.
Пробы помещают в стеклянные банки или в мешки из целлофана или клеенки. Исследуют почву не позднее чем через 2-3 сут. После взятия пробы. При необходимости пробы можно хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев. Для этого их помещают в стеклянные банки, почву в них периодически увлажняют водой и изредка перемешивают (для лучшей аэрации). При хранении в условиях комнатной температуры пробы необходимо залить 3%-ным раствором формалина или 1-2%-ным раствором соляной кислоты.
Исследование на яйца гельминтов
Из образца почвы отбирают примерно 200 г и распределяют на стекле. После перемешивания и разравнивания из разных мест слоя почвы берут в общей сложности около 10 г и помещают в толстостенную колбу. Затем навеску почвы с помощью стеклянных бус тщательно смешивают (в течение часа) с 20 мл 5% раствора гидрооксида натрия.
Полученную смесь в течение 1-2 минут центрифугируют, и избыток щелочи сливают. Осадок тщательно смешивают с насыщенным раствором нитрата натрия (плотность 1,4) и центрифугируют по 2 минуты не менее 5 раз.
После каждого центрифугирования поверхностную пленку снимают и переносят в стаканчик с небольшим количеством воды.
Содержимое стаканчика фильтруют, фильтры исследуют под микроскопом во влажном состоянии, и яйца гельминтовлегко обнаруживаются в поле зрения. Для более детального морфологического изучения яиц делают соскоб содержимого фильтра на предметное стекло в каплю 50% глицерина и рассматривают под микроскопом.
Обнаружение ранней весной в почве (на глубине до 25 см) яиц аскарид с развившимися живыми личинками, указывает на загрязнение почвы, имевшее место летом предшествующего года (яйца развиваются в почве до инвазионной стадии лишь летом в течение 1,5-3 месяцев). Наличие в почве яиц с неподвижными, мертвыми личинками свидетельствует о давнем (свыше 10,5 месяцев) загрязнении почвы. Если еще не поступило дробление яиц, но они не утратили способности к развитию в благоприятных условиях температуры и влажности, давность загрязнения почвы меньше года. Нахождение в пробе почвы, взятой летом и осенью, яиц с живыми личинками показывает, что фекальное загрязнение почвы имеет давность, измеряемую не менее чем 1,5-3 месяцами. Суглинистая почва благоприятна для развития яиц гельминтов, чем супесчаная.
Исследование на личинки гельминтов
-400 г почвы тщательно измельчают и размещают равномерно на кусочке марли, который помещают в металлическое сито с отверстиями 1-2 мм в диаметре. Сито вставляют в стеклянную воронку, наполненную водой (450С) так, чтобы нижняя часть сита была погружена в воду. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом, над которым собираются личинки в силу термотропности, мигрирующие из почвы в теплую воду. Через 4-20 часов от начала анализа открывают зажим и выпускают 50 мл жидкости, которую центрифугируют, и осадок исследуют под микроскопом.
Санитарно-энтомологическое исследование почвы
Для определения загрязнения почвы исследуют наличие в ней личинок и куколок мух, которые проделывают в почве один из циклов своего развития.
Для исследования пользуются рамой-трафаретом размером 25х25 см2, накладываемой на поверхность участка почвы. Внутри трафарета выкапывают почву на глубину 20 см и рассыпают на ровной поверхности. Личинки и куколки вынимают пинцетом и подсчитывают их количество. Результат исследований оценивают по пятибалльной шкале: личинок нет - 1 балл, отдельные экземпляры личинок -2, личинок мало - 3, личинок много - 4 и личинок очень много (кишат) - 5.
Санитарную оценку степени загрязнения почвы по результатам бактериологического и гельминтологического анализов можно проводить по таблице 1.
Используемая литература
8. Гигиена сельскохозяйственных животных. Ч. 2: Зоогигиенический контроль почвы, воды и кормов. Метод. рек.- М.: МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина, 1995.- С. 3-6.
9. Практикум по зоогигиене / А.Ф. Кузнецов, А.А. Шуканов, В.И. Баланин и др.; Под ред. А.Ф. Кузнецова.- М.: Колос, 1999.- С. 47-53.
10.Хохлова И.И. Гигиенические требования к почве и охрана ее от загрязнения.- Горки, 1993.- 24 с.