II. Методы генной инженерии
1. Гибридологический анализ - основной метод генетики. Он основан на использовании системы скрещивания в ряде поколений для определения характера наследования признаков и свойств.
2. Генеалогический метод заключается в использовании родословных. Для изучения закономерностей наследования признаков, в том числе наследственных болезней. Этот метод в первую очередь принимается при изучении наследственности человека и медленно плодящихся животных.
3. Цитогенетический метод служит для изучения строения хромосом, их репликации и функционирования, хромосомных перестроек и изменчивости числа хромосом. С помощью цитогенетики выявляют разные болезни и аномалии, связанные с нарушением в строении хромосом и изменение их числа.
4. Популяционно - статический метод применяется при обработке результатов скрещиваний, изучения связи между признаками, анализе генетической структуры популяций и т.д.
5. Иммуногенетический метод включают серологические методы, иммуноэлектрофорез и др., кот используют для изучения групп крови, белков и ферментов сыворотки крови тканей. С его помощью можно установить иммунологическую несовместимость, выявить иммунодефициты и т.д.
6. Онтогенетический метод используют для анализа действия и проявление генов в онтогенезе при различных условиях среды. Для изучения явлений наследственности и изменчивости используют биохимический, физиологический и другие методы.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
1. специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;
2. быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;
3. конструирование рекомбинантной ДНК;
4. гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью;
5. клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;
6. введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
III. Основные механизмы генной инженерии
(Технология рекомбинантной ДНК)
Суть генной инженерии сводится к следующему: биологи, зная, какой ген за что отвечает, выделяют его из ДНК одного организма и встраивают в ДНК другого. В результате можно заставить клетку синтезировать новые белки, что придает организму новые свойства.
Мы знаем, что обмен генетической информацией происходит и в природе, но только между особями одного вида. Случаи же скрещивания особей разных видов (например, собаки и волка) являются исключением.
Перенос генов от родителей к потомкам внутри одного вида называется вертикальным. Так как возникающие при этом особи, как правило, очень похожи на родителей, в природе генетический аппарат обладает высокой точностью и обеспечивает постоянство каждого вида.
Всё это стало возможно благодаря ферментам – образованиям на основе белка, отвечающим за организацию работы клетки. В частности можно назвать такие ферменты, как рестриктазы. Одна из их функций – защита клетки от инородных генов. Чужая ДНК разрезается этим надёжным стражем на отдельные части, причём существует множество различных рестриктаз, каждая из которых наносит удар в строго определённом месте.
Подобрав набор таких ферментов, можно без труда расчленять молекулу на требуемые участки. Затем необходимо их соединить, но уже по новому. Тут помогает природное свойство генетического материала воссоединяться друг с другом. Помощь в этом оказывают также ферменты лигазы, задача которых заключается именно в соединении двух молекул с образованием новой химической связи.
Непохожий ни на что гибрид создан. Представляет он собой молекулу ДНК, несущую новую генетическую информации. Такое образование в генной инженерии называют вектором. Его главная задача – передача новой программы воспроизводства намеченному для этой цели живому организму. Но ведь последний может её проигнорировать, отторгнуть и руководствоваться только родными генетическими программами.
Такое невозможно, благодаря явлению, которое носит название трансформация у бактерий и трансфекция у человека и животных. Суть его заключается в том, что если клетка организма поглотила свободную молекулу ДНК из окружающей среды, то она всегда встраивает её в геном. Это влечёт за собой появление у такой клетки новых наследственных признаков, запрограммированных в поглощённую ДНК.
Поэтому, чтобы новая генетическая программа начала работать, необходимо только одно, – чтобы она оказалась в нужной клетке. Это сделать не просто, так как такое сложное образование, как клетка, имеет множество защитных механизмов, препятствующих проникновению в неё чужеродных объектов.
Любые преграды можно обойти. Для начала маленькие – к примеру, введение чужеродных генов в бактерии. Здесь, в качестве вектора, вполне можно использовать плазмиду – кольцевую молекула ДНК малых размеров, располагающуюся в клетках вне хромосом и несущую дополнительные половые признаки. Бактерии постоянно обмениваются плазмидами, поэтому не составляет никакого труда перепрограммировать указанную молекулу и направить в клетку.
Значительно более трудно ввести готовый ген в наследственный аппарат клеток растений и животных. Здесь на помощь приходят вирусы – генетические элементы, одетые в белковую оболочку и способные переходить из одной клетки в другую. Для такой работы прекрасно подходят молекулы ДНК вирусов – фаги. Их «переделывают» под нужные параметры и включают в генетический аппарат животного или растительного организма.
Всё, дело сделано. Внедрённый генетический код начинает работать. Иногда бывают сбои, если часть генов новой ДНК окажутся «молчащими». Таких много в каждом организме. У одних живых существ они прекрасно функционируют, у других же не проявляют себя никак.
Накладки и недоработки учитываются и тщательно анализируются. Непрерывно идут работы, изучающие различные комбинации генов: удаление части их из молекулы или наоборот – добавление составляющих, совсем не свойственных данному живому организму.
Горизонтальный перенос генов у прокариот – это не просто лабораторный результат генной инженерии, а распространенное природное явление.
Установлены три основных механизма латерального переноса: трансформация, коньюгация и трансдукция.
1. Т рансформация – это нормальная физиологическая функция обмена генетическим материалом у некоторых бактерий.
2. Конъюгация имеет наименьшее число ограничений для межвидового обмена генетической информацией, но предполагает тесный физический контакт между микроорганизмами, легче всего достижимый в биопленках.
3. Трансдукция (от лат. transductio – перемещение) – это перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью некоторых вирусов (бактериофагов), что приводит к изменению наследственных свойств клетки реципиента.
К наиболее опасным заболеваниям, вызываемым вирусами у животных и человека, относят бешенство, оспу, грипп, полиомиелит, СПИД, гепатит и др. Вирусы обладают вирулентность – это степень болезнетворного действия микроба. Ее можно рассматривать как способность адаптироваться к организму хозяина и преодолевать его защитные механизмы.
Генотерапия
Технологии генодиагностики и генотерапии базируются на мировых достижениях в расшифровке генома человека. Технологии генодиагностики включают разработку приемов точной локализации генов в геноме человека, ответственных за наследственные и соматические заболевания, а также методологии пренатальной и доклинической диагностики. Их важной составляющей является сравнительный анализ структуры генома в норме и патологии.
Генотерапия и генодиагностика - это перспективные технологии фундаментальной и прикладной биомедицины, направленные на лечение и профилактику наследственных (генетических) и приобретенных заболеваний, в том числе онкологических.
В основе генотерапии, развивающейся на базе и в комплексе с генодиагностикой, лежит контролируемое изменение генетического материала клеток, приводящее к "исправлению" не только наследственных, но и, как стало ясно в последнее время, приобретенных генетических дефектов живого организма.
Важнейшей технологической задачей генотерапии является разработка системы переноса или адресной доставки корректирующего генетического материала к клеткам-мишеням в организме больного, несущего в своем геноме дефектный ген. Предлагаемые технологии, характеризуются точностью выявления гена, ответственного за генетический дефект и выбора системы переноса корректирующих генов, адресностью доставки в организм больного генетического материала, исправляющего генетический дефект.
Генотерапия может быть использована для лечения болезней, связанных с мутациями генома (в том числе серповидно-клеточной анемии, эмфиземы, гемофилии и др.), инфекционных заболеваний; для коррекции дефектов центральной нервной системы и для стимуляции иммунного ответа организма при онкозаболеваниях);
Технологии генодиагностики и генотерапии являются инструментом реализации новой медико-биологической стратегии, конечная цель которой - избавление человечества от генетических и приобретенных болезней. Актуальность генотерапии для человека связана с тем, что более 5000 наследственных и приобретенных заболеваний связано с генетическими дефектами. Генотерапия может использоваться не только для лечения, но и для профилактики наследственных и приобретенных заболеваний. Таким образом, данная технология имеет большое социальное и народнохозяйственное значение.
За рубежом генодиагностика и генотерапия рассматриваются как один из приоритетов развития биомедицины. К настоящему времени одобрено более 7 протоколов по генотерапии, в которых предложены способы лечения наследственных заболеваний. Такие протоколы разрабатываются в Китае, Франции, Великобритании, Италии, Нидерландах и ряде других стран. В США Национальным Комитетом по рекомбинантным ДНК (RAC) одобрено 18 клинических испытаний с использованием генотерапии, начато лечение одного из видов рака кожи - меланомы.
В Российской Федерации также освоены основные технологии генотерапии - секвенирование, физическое и генетическое картирование генома человека и животных, осуществляется расшифровка молекулярных механизмов наследственных и онкозаболеваний, решаются проблемы генетической безопасности человека, сохранения его генофонда в условиях разрушающего антропогенного воздействия среды. Вместе с тем, для достижения зарубежного уровня в этой области России необходимо принять срочные меры по увеличению финансирования НИОКР и по усилению приборного обеспечения. Необходимым условием развития предлагаемых технологий в