Глава 19. Молекулярно-генетическая диагностика химерных онкогенов
Кекеева Т.В., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Залетаев Д.В.
Хромосомные перестройки и образующиеся в результате химерные гены являются частым событием в канцерогенезе. В настоящий момент известно более 440 химерных генов, описанных как для злокачественных, так и для доброкачественных новообразований. Химерные белки являются идеальными маркерами, специфичными для опухолевой нозологии, одновременно выступая потенциальными мишенями для таргетной терапии вследствие того, что в большинстве своем они являются пусковыми элементами канцерогенеза. В течение 25 лет считали, что химерные гены характерны для канцерогенеза только гематологических и мягкотканных опухолей. Возможность наличия химерных генов в эпителиальных опухолях, таких как рак молочной железы (РМЖ), рак легкого (РЛ), рак предстательной железы (РПЖ), фактически игнорировали. Область поиска специфичных опухолевых изменений ДНК была сфокусирована на изучении точечных мутаций, амплификаций, делеций, потери гетерозиготности, а также метилирования в генах-супрессорах опухолевого роста. В то же время изучение лейкозов, лимфом и сарком было почти полностью сосредоточено на поиске хромосомных перестроек, приводящих к образованию химерных генов. Такое неоправданное разделение в области молекулярно-генетических исследований онкологических заболеваний, в основном, связано с методологическими аспектами. В настоящее время достижения молекулярно-цитогенетических технологий позволяют с высокой эффективностью выявлять ранее не видимые транслокации и другие сложные аберрации хромосомных районов в большинстве тканей. Помимо этого, развитие молекулярно-генетических методов позволяет выявлять химерные гены на уровне их экспрессии, т.е. без определения хромосомной перестройки. Далее мы немного подробнее остановимся на современных технологиях выявления химер.
Методы выявления химерных генов.
Химерные гены могут быть образованы в результате различного рода перестроек: сбалансированных транслокаций, несбалансированных транслокаций, делеций, инверсий, инсерций, тандемных дупликаций, а также в результате так называемого цис- и транс-транскрипционного сплайсинга.Различные методы диагностики химерных генов дают возможность выявлять только определенные типы хромосомных аберраций. Основными методами детекции известных химерных генов являются ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). С их помощью можно определять химеры в свежем, замороженном, фиксированном в формалине и залитом в парафин материале, включая тонкоигольные биопсии. Метод FISH по сравнению с ОТ-ПЦР имеет преимущество, т.к. позволяет проведение диагностики на фиксированных формалином парафиновых блоках, которые, как правило, являются единственным возможным материалом для исследования. Вследствие нестабильности РНК анализ экспрессии химерного транскрипта методом ОТ-ПЦР в парафиновых блоках является сложной задачей, решение которой, однако, необходимо для идентификации и характеристики химерного гена. Учитывая также сложности интерпретации результатов FISH при неадекватной предварительной обработке материала, использование обоих методов детекции химерного гена в клинической диагностике представляется крайне желательным.
Еще несколько лет назад подходов к системному поиску новых химерных транскриптов не существовало. Так, химеры, обнаруженные в эпителиальных опухолях, были выявлены непрямыми методами, подходящими только для данных конкретных случаев. Например, специфичные для рака предстательной железы (РПЖ) химерные гены обнаружили посредством компьютерного анализа экспрессии генов в опухолевых образцах, химеры рака легкого (РЛ) - с помощью методов трансфекции. В настоящее время можно выделить 2 системных подхода к поиску химерных генов, которые были разработаны практически одновременно. Первый подход, на основе молекулярно-цитогенетических методов, оценивает изменения на хромосомном уровне (модификации методов FISH и сравнительной геномной гибридизации (CGH)), второй подход использует новые технологии секвенирования.
Химерные гены в норме.
Явление межгенного сплайсинга или химеризма, обусловленного транскрипцией (transcription induced chimerism - TIC), описано менее 5 лет назад. Выделяют два вида сплайсинга: транс-сплайсинг подразумевает наличие двух различных молекул РНК генов, находящихся на разных хромосомах, цис-сплайсинг – результат слияния РНК двух близкорасположенных генов в одну объединенную молекулу мРНК (рис. 1).
Предполагают, что в образовании химер могут участвовать более 400 генов. Так, в работе Akiva описано 212 возможных химерных сплайсингов. По всей видимости, данное количество будет стремительно увеличиваться, некоторые исследователи предполагают, что от 2 до 5% всех генов может быть вовлечено в процесс межгенного сплайсинга.
В работе Li и соавт. описано явление транс-сплайсинга на примере химерного транскрипта JAZF1/JJAZ1 в образцах нормальной ткани эндометрия. Описанные химерные РНК и белок идентичны тем, что образуются в результате транслокации. Результаты блот-гибридизации по Саузерну и FISH-анализа свидетельствуют об отсутствии в образцах соответствующей транслокации t(7;17)(p15;q21), которая и приводит к появлению химерного онкогена JAZF1/JJAZ1 при стромальной саркоме эндометрия. Можно предположить, что химера играет индуцирующую роль ростового фактора в нормальном развитии, а возникающая при патологии соответствующая транслокация вызывает необратимое изменение, приводящее к злокачественной трансформации. Высказывают мнение, что процесс транскрипционного сплайсинга химерных РНК может способствовать сближению хромосомных районов и, таким образом, инициировать хромосомные транслокации. Однако некоторые работы показывают, что сближение хромосомных районов не является существенным механизмом для возникновения перестройки. Безусловно, необходимы исследования механизмов образования других сплайсинговых химерных транскриптов для того, чтобы можно было делать какие-либо выводы.
В качестве примера цис-сплайсинга можно привести еще один, довольно хорошо охарактеризованный, химерный транскрипт, который состоит их двух членов семейства TNF лигандов, TNFSF12 (17p13) и TNFSF13 (17p13), представляющими собой трансмембранный и секретирующийся белки, соответственно. Доказано, что химерный белок является биологически активным лигандом, экспрессирующимся на поверхности T-клеток и моноцитов.
Ответ на вопрос, что собой представляет обусловленный транскрипцией химеризм, остается пока неразрешенным. Высказываются два противоположных мнения. Одни исследователи считают, что TIC является физиологическим процессом, характерным для нормальных тканей, поддерживающим эволюционные механизмы. Другие склоняются к тому, что межгенный сплайсинг - новый патологический механизм, лежащий в основе некоторых нервно-мышечных, гематологических или онкологических заболеваний, на который можно воздействовать антисмысловыми РНК. К настоящему моменту понятно, что TIC более широко распространен в геноме человека, чем предполагалось ранее и формирует дополнительный уровень белковой вариабельности. Дальнейшее изучение роли межгенного сплайсинга должно ответить на вопрос, какую роль этот процесс играет в образовании химерных онкогенов и канцерогенезе.
Типы химерных генов.
Результатом образования химерных транскриптов могут быть новые белки с измененными функциями или гиперэкспрессия уже существующих белков. Наиболее простое событие – это слияние регуляторного промоторного элемента одного гена с 5’-областью другого гена, приводящего в результате к эктопической экспрессии неизмененного полноразмерного генного продукта, так называемая «подмена» промотора (рис. 2). Вторым вариантом событий может быть образование нового белка, обладающего иной функцией. Накоплено много данных, свидетельствующих о том, что такие химерные гибридные гены играют важную роль в инициации канцерогенеза. На экспериментальных животных моделях показано, что у трансгенных по химерным генам животных формируются опухоли, схожие с теми, которые наблюдаются у человека при соответствующих молекулярно-генетических нарушениях. Так, например, в экспериментах in vivo была исследована трансформирующая активность химерного гена синовиальной саркомы (СС) SYT/SSX2 в клеточной культуре фибробластов, которые, при имплантации мышам, формировали опухоль, напоминающую СС. В свою очередь, ингибирование in vitro химерных транскриптов посредством малых интерферирующих РНК (миРНК) приводит к снижению пролиферативной активности опухолевых клеток и восстановлению их дифференцировки.
Гибридные химерные гены составляют примерно 75% всех известных химерных генов и идентифицированы в различных гематологических и солидных опухолях, локализованных в эпителиальных, нервных, жировых, фибробластных, мышечных, сосудистых, хрящевых и костных тканях. Не существует принципиальных различий между генами, образующими химеры, в опухолях различных гистологических типов. По функциональным особенностям можно выделить две основные группы генов-участников – транскрипционные факторы и тирозинкиназные рецепторы, на которые приходится до 50% всех вовлекаемых генов.
В большинстве случаев, химерные гены высокоспецифичны для своего типа опухоли. Однако существует ряд исключений. Так, транслокация t(12;15)(p13;q25), приводящая к слиянию гена ETV6 c геном тирозинкиназного рецептора NTRK3, обнаружена в совершенно гистогенетически различных опухолях, таких как острый миелобластный лейкоз (ОМЛ), мезобластная нефрома, мягкотканная фибросаркома и секреторный рак молочной железы. Другим примером является мукоэпидермоидная карцинома и светлоклеточная гидраденома, для обоих типов опухолей обнаружены транслокации t(11;19)(q21;p13) и t(6;22)(p21;q12) c образованием химерных генов MECT1/MAML2 и EWSR1/POU5F1 соответственно. Транслокация t(2;3)((q13;p25), приводящая к образованию химеры PAX8/PPARG1, описана в фолликулярном варианте папиллярного рака щитовидной железы и фолликулярном раке щитовидной железы. Приведенные примеры могут свидетельствовать о том, что данные перестройки являются лишь фоновыми процессами общих для всех клеток опухолевых изменений, как в случае с транслокацией t(12;15)(p13;q25). Как один из вариантов событий можно предположить, что некоторые опухоли развиваются из одних и тех же клеток-предшественников, к настоящему моменту еще не идентифицированных. В соответствующем органном микроокружении они формируют разные фенотипы (мукоэпидермоидной карциномы и светлоклеточной гидраденомы), но несут в своем генотипе первичные транслокации. Третьим вариантом объяснения подобного феномена может быть морфологическая классификация опухолей, основанная на ошибочных признаках, не являющихся ключевыми моментами гистогенеза, например в случае фолликулярного варианта папиллярного рака щитовидной железы и фолликулярного рака щитовидной железы. В этой связи, постепенно осознается необходимость реклассификации опухолей на основании их патогенетических изменений, причем при тесном взаимодействии различных специалистов, онкологов, патологоанатомов, молекулярных биологов. Данная классификация уже принята для некоторых гематологических опухолей, и подобное предложение высказывается для ряда сарком. Видимо, классификация некоторых эпителиальных опухолей также, в скором времени, подвергнется пересмотру.
Химерные онкогены в гематологии.
На сегодняшний день для гематологических заболеваний описано 264 химерных гена, вовлекающих 238 различных генов (табл. 1). Это составляет 75% всех химер, известных в онкологии. Первая работа, описывающая специфическую для опухоли транслокацию, была опубликована в 1973 г Rowley. В настоящее время целый ряд гематологических нозологий выделяется классификацией ВОЗ исключительно на основании наличия или отсутствия специфической транслокации и химерного гена.
Механизм образования разнообразного пула антител в В-клетках включает в себя разрывы и рекомбинацию ДНК генов, кодирующих иммуноглобулины. В результате вероятность аберрантной рекомбинации между генами иммуноглобулинов (Ig) и другими локусами резко увеличивается, и такие патологии, как В-клеточные лимфомы, лейкозы и опухоли плазматических клеток часто характеризуются наличием транслокаций между генами Ig тяжелых цепей (IgH) или генами легких цепей (Igκ или Igλ) и онкогенами с-myc или членами семейства bcl. Так, лимфома из клеток мантийной зоны несет транслокацию, приводящую к слиянию генов IgH и CCND1, для диффузной В-крупноклеточной лимфомы характерны перестройки между IgH, Igκ или Igλ и bcl-2, bcl-6 или с-myc, в лимфоме Беркита обнаруживают химеру IgH/с-myc.
Классическим примером транслокации, приводящей к возникновению химерного гена, является t(9;22)(q34;q11), встречающаяся более чем в 90% случаев хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ). В результате данной транслокации объединяются 5'-область гена BCR и 3'-область гена ABL1, что приводит к увеличению тирозинкиназной активности.
Маркером лимфомы из клеток мантийной зоны является транслокация t(11;14)(q13;q32), выявляемая с частотой до 100%. При этой транслокации происходит перестройка локусов протоонкогена CCND1(BCL1) и генов IgH, приводящая к гиперэкспрессии белка циклина D1, что, как полагают, являются пусковым моментом канцерогенеза данной лимфомы.
Основным диагностическим критерием лимфомы Беркита является транслокация с перестройкой гена с-myc. В 80% случаев обнаруживается транслокация t(8;14)(q24;q32) с перемещением с-myc в локус тяжелых цепей иммуноглобулина (рис. 3), в 20% случаев возможны транслокации t(2;8)(q24;p12) и t(8;22)(q24;q11) с перемещением в локусы легких цепей. Следствием транслокации является нарушение регуляции с-myc (его гиперэкспрессия), что приводит к увеличению пролиферации опухолевых клеток.
При ОМЛ или остром промиелоцитарном лейкозе нобнаруживается транслокация t(15;17)(q22;q12), в результате которой происходит слияние гена рецептора ретиноевой кислоты (RARA) и гена регуляторного фактора PML. В редких случаях встречаются другие вариантные перестройки, вовлекающие ген RARA (t(11;17)(q23;q12), t(5;17)(q35;q12)), в таких случаях диагноз звучит как ОМЛ с вариантной транслокацией гена RARА.
Диагностической для фолликулярной лимфомы является транслокация t(14;18)(q32;q21), встречаются также более редкие варианты: t(2;18)(р12;q21) и t(12;18)(q21;q11) – перестройки локуса гена BCL2 /18q21 и локусов генов тяжелых и легких цепей IgH. Результатом транслокации является гиперэкспрессия ингибитора апоптоза белка bcl2.
В целом, около 15-30% ОЛЛ и зрелых B- и Т-опухолейхарактеризуются наличием химерных генов, и менее 1% химерных генов показано для ходжкинских лимфом, миелодиспластических синдромов и хронических миелопролиферативных заболеваний. Таким образом, мнение, что для большинства гематологических заболеваний характерны химерные гены, является несколько преувеличенным. Однако в случаях, когда специфические транслокации известны, их определение является неотъемлемой стандартной диагностической процедурой для гематологической верификации.