Лекция 5
1..Ген и генотип организма
2. Норма реакции и фенотип
3. Классификация генов Регуляция активности генов
4. Генная инженерия.
5. Клональное микроразмножение
Ген – участок ДНК, ответственный за синтез одного белка
На генах записана наследственная программа синтеза белков, которая реализуется в клетке.
Генотип – совокупность всех генов организма
На разных этапах роста и развития организма в его клетках с ДНК считывается лишь часть наследственной программы, и синтезируются лишь те белки, которые необходимы в данный момент.
Благодаря этому возникают клетки с разными белковыми комплексами.
Между организмом и средой существует тесная связь: конкретному комплексу факторов среды отвечает соответствующая реакция генотипа.
При изменении условий среды изменяются биохимические процессы, происходящие в клетке.
Часть генов, с которых считывалась наследственная информация, подавляются и синтезируются новые белки, которые отвечают изменившимся условиям.
При этом изменяются внутренние и внешние признаки и свойства организма.
Следовательно, генотип любого организма обладает известной широтой
В организме сразу никогда не реализуется вся наследственная информация.
Всегда имеется запас наследственных возможностей, позволяющий организму, приспосабливаться к новым условиям среды
Норма реакции – наследственно закрепленные пределы модификационной изменчивости у конкретного организма, проявляемой при колебаниях условий окружающей среды. Среди генетических факторов, обуславливающих флуктуации признаков в пределах нормы реакции – полигенная детерминация, плейотропизм, гетерозиготность.
Плейотропизм – множественное действие гена, когда один ген ответственен за ряд фенотипических эффектов.
Полигенная детерминация – совместное действие нескольких генов на один признак.
Гетерозиготность – особи имеющие локусы, которые состоят из разных аллелей и составляют одну пару. Аллели отвечают за один признак, но разнонаправлены.
Фенотип – совокупность всех внешних и внутренних структур и функций организма, которая может быть описана и изучена морфологическими, анатомическими и физиологическими методами. Фенотип формируется на основе генотипа в процессе индивидуального развития, является одним из вариантов нормы реакции организма на воздействие внешней среды и характеризуется изменчивостью. Фенотип – частный случай выражения генотипа, т. к. генотип никогда не может проявляться полностью. Термин введен В.Иогансеном в 1903 году
Одним из наиболее интригующих и в то же время наименее изученных вопросов в молекулярной генетике является регуляция активности генов и, следовательно, всего метаболизма клеток. Как и почему включается в работу в данный момент именно этот ген, а не какой либо другой? Почему одни клетки все время делятся, а другие не делятся совсем? Почему в одной клетке интенсивно вырабатывается один белок, а в другой иной? Как включаются и выключаются гены в процессе онтогенеза. Каждая из клеток в организме животного или растения содержит одинаковое, определенное для того или иного вида количество хромосом. Предполагается, что каждая из однотипных хромосом в любой клетке содержит ДНК одинаковой структуры. Тем не менее, клетки сильно различаются по своему строению и, что важнее, по своей функции.
После оплодотворения, на протяжении первых нескольких актов деления первоначальной клетки, все клетки остаются идентичными. Но вскоре что-то побуждает их становиться тканями и органами. Существует некий механизм контроля активности генов. Этот механизм саморегулирующийся, и его можно сравнить с механизмом термостатического контроля системы центрального отопления. Если настроить термостат на определенную температуру, то центральное отопление включается сразу же, как только температура станет ниже установленной.
Впервые объяснение автоматической системы контроля производства ферментов было предложено в начале 1960 годов Жаком Моно и Жерменом Коэн-Базиром из пражского Пастеровского института.
Механизмы включения и выключения генов являются частью общего процесса генного регулирования. Генная регуляция широко исследовалась на бактериальных клетках
Регуляция активности генов. Индукция
В процессе эволюции живой материи и меняющихся условий среды природой был создан механизм регуляции действия генов. Геном каждой клетки приобрел характер комплекса, состоящего из так называемых структурных генов, непосредственно кодирующих синтез белков, молекулы транспортных и рибосомных РНК; генов-регуляторов, которые обеспечивают упорядоченность в действии структурных генов.
Регуляция активности генов осуществляется опероном, который состоит из различных генов, расположенных друг за другом:
- структурных генов; эти гены кодируют производство ферментов, участвующих в той или иной реакции;
- гена промотора; к нему присоединяется РНК-полимераза;
- гена оператора; этот ген контролирует производство иРНК.
Вне оперона содержится ген-регулятор, который производит молекулы – репрессоры, препятствующие действию гена оператора.
Процесс включения генов (процесс индукции делится на три стадии:
1 Производство молекулы репрессора (белка).
- ген регулятор, находящийся на некотором удалении от оперона синтезирует белок, называемый репрессором.
- При отсутствии субстрата репрессор может блокировать синтез РНК-полимеразы.
- Это препятствует транскрибции генов, кодирующих производство конкретного фермента.
2. Присоединение индуктора (субстрата) к белку-репрессору.
- Это обратимая реакция, которая может происходить только при высокой концентрации субстрата.
- Индуктор соединяется с репрессором, что предотвращает соединение репрессора с РНК-полимеразой.
РНК-полимераза может выполнять свои функции, и структурные гены могут синтезировать белок.
3. Транскрипция генов и производство ферментов.
- Как только белок-репрессор блокируется, РНК-полимераза может получать доступ к гену оператору.
- Синтезируется фермент.
- Такой механизм позволяет клетке синтезировать ферменты только при достаточной концентрации субстрата, то есть производство ферментов индуцируется наличием субстрата.
Регуляция активности генов. Репрессия
В этом процессе также участвует оперон, и его можно разделить на следующие три стадии:
Репрессор поначалу не является активным.
- Когда концентрация субстрата (триптофана) низка молекулы репрессора принимают неактивную форму и не могут соединится с оператором.
- Транскрипция структурных генов не блокирована.
Репрессор активизируется.
- Когда концентрация субстрата (триптофана) велика, он связывается с молекулой репрессора и меняет ее форму.
Репрессор связывается с оператором.
- Изменение формы молекулы репрессора позволяет ей связаться с оператором.
- В результате транскрипция становиться невозможной. Структурные гены не могут транскрибироваться, поскольку РНК-полимераза не может связаться с оператором.
При генной индукции гены обычно «выключены». Индуктором служит субстрат.
При генной репрессии гены обычно включены». Высокая концентрация конечного продукта метаболического процесса активизирует молекулу репрессора.
Развитие науки о генах и генотипах привело к развитию новой науки _генетической инженерии.
Генетическая инженерия – генетическое конструирование живых организмов состоит из двух разделов: генной инженерии и геномной инженерии.
Генная инженерия методами in vitro решает задачи введения в геном реципиентной клетки одного или нескольких чужеродных генов, либо создание в геноме новых типов регуляторных связей. В таких случаях видовая принадлежность организмов не меняется, но появляются не свойственные им признаки.
Геномная инженерия осуществляет более глубокое вмешательство в геном, вплоть до создания новых организмов.
Особые успехи генетической инженерии связаны с так называемой векторной трансформацией. В основе этого подхода лежит использование векторных молекул, или векторов, в качестве которых применяют плазмиды. Векторы – это молекулы ДНК, способные переносить включенные в них гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Плазмиды – это внехромосомные факторы наследственности, способные стабильно существовать в клетке в автономном, не связанном с хромосомами состоянии. К плазмидам относят генетический аппарат клеточных органоидов (митохондрий, пластид), а также группы сцепления генов, не являющиеся жизненно важными для содержащих их клеток. Из последних наиболее изучены бактериальные плазмиды – фактор фертильности, факторы устойчивости к лекарственным веществам и др.
Практическое использование векторов в селекции растений относится к последним десятилетиям и связано с Ti-плазмидой почвенной бактерии Агробактериум тумефациенс, которая вызывает опухолевое заболевание растений. На базе Ti-плазмиды были созданы векторы, способные интегрироваться в растительные хромосомы. Это дало возможность вводить в клетки растений чужеродные гены и получать из одной единственной клетки сформировавшееся растение. Организмы, в которых чужеродные гены обнаруживаются во всех клетках, включая половые, называются трансгенными. Они обладают свойством передавать приданные им новые признаки своему потомству.
Первыми чужеродными генами, веденными в начале 80-х годов в высшее растение, были гены устойчивости к антибиотикам из бактерии Escherichia coli.
Генные инженеры занимаются выявлением интересующих их генов, клонированием генов, составлением рекомбинантных ДНК, генной терапией и модификацией генов. Если говорить вкратце, то работа генного инженера состоит в следующем: необходимо определить отдельный ген, вырезать его из хромосомы одного вида и внедрить в хромосому другого вида. После многократной репликации гена возможно получение продукта в виде белка. Основное преимущество такой технологии состоит в том, что становиться возможным массовое производство редких и дорогих органических веществ.
Генные инженеры в своей работе используют исключительно специфические инструменты и пользуются особой терминологией.
ДНК-источник содержит необходимый ген, который вырезают и добавляют к ДНК-хозяину.
ДНК-хозяина разрезают, чтобы внедрить ДНК-источник
Рекомбинантная ДНК представляет собой гибрид, полученный в результате слияния ДНК-источника и ДНК-хозяина.
Рестриктазы – это особые ферменты, которые разрезают ДНК в специфических местах и позволяют ДНК-источнику внедриться в ДНК-хозяина.
Развитие генной инженерии связано с клональным микроразмножением.
Традиционным способом получения клонов у древесных видов растений является черенкование с последующим укоренением черенков или прививкой. Клональное микроразмножение является принципиально новым способом получения клонов, основанным на методе культуры органов и клеток in vitro. С помощью этого способа за довольно короткий срок можно получить большое количество однородного посадочного материала. Клональным микроразмножением называют массовое бесполое размножение растений в культуре тканей и клеток, при котором возникшие формы растений генетически идентичны исходному экземпляру. Клональное микроразмножение значительно ускоряет селекционный процесс, при размножении растений в культуре тканей происходит оздоровление посадочного материала, освобождение его от патогенных микроорганизмов и во многих случаях от вирусов. Методом культуры тканей удается размножить растения, которые с трудом или совсем не размножаются вегетативно.
Работы по культивированию клеток и тканей растений проводят в асептических (стерильных) условиях. Получение растений с помощью клонального микроразмножения включает в себя следующие этапы технологического процесса:
1. Приготовление питательных сред;
2. Получение асептической культуры;
3. Культивирование эксплантов;
4. Укоренение побегов;
5. Адаптация клональных растений к почвенным условиям;
6. Длительное хранение клонированных растений.
Эффективность микроразмножения в значительной степени зависит от правильного выбора питательной среды. Для культивирования органов и тканей чаще применяют твердую агаросодержащую среду. Любая питательная среда включает следующие группы веществ: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, аминокислоты, регуляторы роста гормональной природы. При клональном микроразмножении растений наиболее часто используют специально разработанные среды Мурасите-Скуга и WPM. Обязательным условием является присутствие в среде кроме элементов питания гормональных факторов, которые способствуют дифференциации каллусных клеток.
Исходным материалом при получении культур тканей растений могут служить любые органы растений, растущие в полевых условиях. Для микроразмножения древесных растений используют два вида исходного материала: 1) семена и их отдельные части, а также части проростков; 2) молодые ткани взрослых растений (почки, хвоя, ткани листа, побеги). Перед введением в культуру эксплант стерилизуют. В качестве растворов для стерилизации используют хлорамин, хлорную известь и другие вещества, содержащие активный хлор, или же ртутьсодержащие растворы. Перед посадкой на питательную среду материал ополаскивают в стерильной воде.
Экспланты после стерилизации помещают на питательную среду. После четырех недель культивирования формируются многочисленные адвентивные побеги. Адвентивные побеги длиной 0,3–0,5 см, отделяют от экспланта и пересаживают на свежую среду.
Для укоренения используют 1–2-почечные сегменты побегов длиной 1 см. Для этого пучки побегов подходящего размера достают из культуральных сосудов и помещают в чашки Петри, где и производят отбор для укоренения. Подготовленные побеги и сегменты побегов помещают базальным концом в агаровую среду и культивируют на свету в течение 4 недель. Первые корешки появляются через 10 дней.
Для высадки в почву используют те растения, которые достигли определенных размеров (длина корней не менее 10 см, высота 4 см.) В качестве субстрата используют торф и песок в соотношении 2:1.