В качестве стимуляторов синтеза каротина используют β-ионон.Данные об энзиматическом включении β-ионона в образование бета-каротина отсутсвуют, поэтому рассматривать его в качестве прешественника нельзя. Однако существуют предположения, что β-ионон в клетке грибов связывается с каким-то рецепторным белком и этот комплекс стабилизирует мРНК каротиногенных ферментов. Как заменители β-ионона используют также изопреновыедимеры или тримеры, а также циклогексан, циклогексанон и их триметилпроизводные, среди которых наиболее эффективен 2,6,61-триметил-1-ацетилциклогексан (ТАЦ). Активаторами каротиногенеза у В. trispora могут быть также α-пирролидон, сукцинимид, и изониазид. Добавление этих активаторов, особенно изониазида, на фоне действия β-ионона или ТАЦ позволяет значительно увеличить выход каротиноидов. Стимуляторы добавляются к культуре продуцента после окончания периода интенсивного роста биомассы.
Ингибитором роста некоторых штаммов гриба может являться сам β-ионон[7]. Ингибирование снижается за счет добавления различных растительных масел или заменой β-ионона на другой стимулятор процесса каротиногенеза. Подсолнечное масло также усиливает рост биомассы и выход бета-каротина за счет присутствия в его составе различных жирных кислот: линолевой, олеиновой, пальмитиновой и стеариновой.
Очень важной проблемой при производстве каротиноидов является окисление конечного продукта. При искусственном стимулировании биосинтеза каротиноидов не в полной мере синтезируются соответствующие природные антиоксиданты типа ренолпроизводных соединений. Поэтому существует необходимость введения в среду дополнительных неприродных антиоксидантов, стабилизирующих каротинсодержащий мицелий,например, для этих целей используется сантохин[8].
Роль индуктора в биосинтезе бета-каротина выполняют триспоровые кислоты (ТСК). Триспоровые кислоты – гормоноподоные факторы. Они способствуют образованию зигофор у (+) и (-) форм мукоровых грибов, таким образом, ТСК регулируют одну из стадий полового процесса.Триспоровые кислоты являются авторегуляторными сигнальными молекулами, которые осуществляют коммуникацию между (+) и (–) штаммами гриба[9].Сами ТСК образуются из бета-каротина через ретиналь. Кислоты не включаются в молекулу β-каротина, а только активируют ферменты, контролирующие биосинтез этого пигмента. Посредством индукции фитоинсинтазы и ликопинциклазы, триспоровые кислоты ТСК стимулируют синтез каротиноидов [10].
Хотя триспоровые кислоты и вызывают сильный стимулирующий эффект на выход β-каротина (увеличивают интенсивность дыхания), и несмотря на то, что их использование позволило бы осуществлять процесс ферментации только с одним продуцентом – (-) штаммом, на практике этот способ не получил широкого применения из-за высокой стоимости триспоровых кислот и их нестабильности.
Возможности генной инженерии
Используемые штаммы продуцентов были получены из прототипов. K1+и K1-селекционированы методом последовательного мутагенеза на реплицирующейся ДНК гриба с использованием нитрозогуанидина (алкилирующий мутаген, производит алкилирование гуанина) в концентрации 500 мкг/мл при выживаемости 0,02-0,1% для K1+и комбинированного действия УФ-облучения (выживаемость 5-7-10%) и нитрозогуанидина в указанной концентрации. Высокоэффективная пара штаммов KP 74+и KP 86-гриба Blakesleatrispora получена путем совместного культивирования штаммов K1+и K1-[5].
В настоящее время ведутся работы, направленные на удешевление и стандартизацию микробиологического способа получения каротиноидов с использованием методов генной инженерии, осуществляемые в двух направлениях:
1. гены, контролирующие путь биосинтеза определенного каротиноида, должны быть клонированыв организм, способный быстро расти на экологически чистых и дешевых средах;
2. путь биосинтеза каротиноида должен быть так изменен в родительском организме, чтобы превратить его в сверхсинтетика этих пигментов.
Так, например, проводятся исследования о введении в ДНК дрожжей Saccharomycescerevisiae генов из бактерии Erviniauredonova и Er. herbicola, кодирующих биосинтез β-каротина и ликопина.
Для практического использования можно также рассматривать высокопродуктивный мутант дрожжей Rhodosporidiumdiobovatum. На основе данного штамма возможно получениекаротинсодержащего белкового препарата.