Обсуждена и утверждена на заседании кафедры.

Ф КГМУ 4/3-06/02

ИП №6 УМС при КазГМА

От 14 июня 2007 г

КАРАГАНДИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра молекулярной биологии и медицинской генетики

Методические рекомендации для семинарских занятий

(TBL)

Тема 30: Исследование структурных нарушений хромосом в соматических клетках методом кариотипирования.

Специальность: 5В130100– общая медицина

Дисциплина: Молекулярная биология и медицинская генетика

Курс: 1

Составители:

Кислицкая В.Н.

Татина Е.С.

КАРАГАНДА 2013

Обсуждена и утверждена на заседании кафедры.

Протокол № _01_ от «_02_» __09__2013

Зав. кафедрой ____________________Б.Ж. Култанов

Тема 30: Исследование структурных нарушений хромосом в соматических клетках методом кариотипирования.

Форма проведения: практическое (лабораторное занятие).

Микроскопические методы изучения хромосом человека применяются с конца XIX века. Цитогенетические методы предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом. Наиболее распространенным методом в цитогенетике человека является световая микроскопия. Электронная и конфокальная лазерная микроскопия применяется в современной цитогенетике только с исследовательскими целями. Во всей медико-генетической практике применяется световая микроскопия (главным образом в проходящем свете), включая люминесцентную микроскопию.

Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Каждый из этих объектов имеет преимущества и недостатки. Выбор объекта определяется целью исследования.

Большинство цитогенетических исследований выполняется на соматических клетках, поэтому остановимся на описании этих методов.

Объект исследования: кровь икостный мозг лабораторных животных.

Ход работы:

Для стимуляции методической активности животным за 2 ч до забоя вводят 2,5 мг/кг колхицина.

Всех животных забивать под эфирным наркозом методом неполной декапитации через 24 часа после введения препарата. У животного выделяется бедренная кость, из которой шприцом с небольшим количеством физиологического раствора вымывается костный мозг.

Осадить клетки центрифугированием, отбросить супернатант и ресуспендировать осадок в 5 мл гипотонического раствора 0,075 М КCI при 37⁰С.

После 10-15 мин инкубации при 37⁰С собрать клетки центрифугированием при 100g в течение 10 мин и отбросить супернатант, ресуспендировать клетки небольшом объеме (примерно 1-2 объёма клеточного осадка) гипотонического раствора KCI.

Медленно добавить 2 мл свежеприготовленного фиксатора (фиксатор должен охлажден) при постоянном помешивании (пипетировании пастеровской пипеткой, встряхиванием или с помощью вортекса).

Через 20 мин или более осадить клетки центрифугированием, отбросить супернатант и ресуспендировать клетки в 2 мл свежего фиксатора. Дать суспензии постоять при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Осадить клетки центрифугированием при 100g в течение 2 мин, отбросить супернатант и ресуспендировать клетки в небольшом объёме (примерно 10-15 объёмов клеточного осадка) свежего фиксатора.

Для приготовления препаратов нанести суспензию по каплям на чистое холодное (4⁰С) предметное стекло, наклоненное под углом 45⁰; слегка покачивая стекло, дать суспензии растечься по поверхности и высушить на воздухе при комнатной температуре.

Обследовать препарат в фазово – контрастном микроскопе. Метафазные пластинки должны быть равномерно и без перекрывания распределены по поверхности стекла. Плотность клеток на стекле можно регулировать, меняя число капель суспензии или изменяя концентрацию клеток в суспензии.

Окрасить препарат краской по Гимза-Романовского в течение 1-15 мин; ополоснуть водопроводной водой и высушить на воздухе.

Приготовленные препараты микроскопируют. Анализу подвергают 100 метафазных клеток каждого животного.

Результаты представляют:

1. общее число проанализированных клеток;
2. процентное соотношение из них аберрантных;
3. спектр аберраций и процентное соотношение их;
4. значение X² статистики соотношения нормальных и аберрантных метафазных клеток в подопытных и контрольных группах.

Реактивы: колхицин, эфир, физиологический раствор, гипотонический раствор КCI, ацетоорсеин, этанол, уксусная кислота, краситель Гимза-Романовского.

Приборы и оборудование: шприц, пастеровская пипетка, центрифуга, предметное стекло, фазово – контрастный микроскоп, термостат.

Значение: предложенное практическое занятие позволяет освоить методы определения хромосомных абберации т.е. количественные и качественные изменения хромосом. В зависимости от цели и метода окраски определяются числовые аномалии кариотипа, структурные нарушения хромосом, степень мутагенности факторов окружающей среды.