Тема «Особенности индукции облучением точковых и хромосомных мутаций. Связь с репарацией (доказательства)»
Студента 4 курса
Сокращенной формы обучения
Группа А82МЕЭ2
Конецпольская Наталья Николаевна
Зачетная книжка №1849241
Оценка __________
Дата_____________
Подпись преподавателя_____________
Минск 2021
Оглавление
Особенности индукции облучением точковых и хромосомных мутаций. 3
Связь с репарацией. 15
Список литературы.. 17
Особенности индукции облучением точковых и хромосомных мутаций
Термин „точковая мутация” долгое время понимался разными исследователями по-разному, поэтому следует уточнить, что согласно современным представлениям точковыми мутациями мы называем стабильные изменения на уровне нуклеотидов ДНК. При образовании точковой мутации не нарушается целостность хромосомы и не затрагивается ее белковый компонент.
Предположение о разной зависимости выхода точковых и хромосомных мутаций от эффективности репарационных систем было высказано нами в 1974г. и подтверждено работами последних лет.
Данные, свидетельствующие о независимости или слабой зависимости формирования точковых мутаций от интенсивности процессов репарации, получены при исследовании различных факторов.
Радиочувствительность стадий гаметогенеза. В радиобиологии существует установившееся мнение о том, что радиочувствительность разных стадий гаметогенеза различна. Такое явление объясняется разной эффективностью репарационных процессов на разных стадиях. Однако это положение верно лишь для мутаций аберрантного происхождения. Что же касается точковых мутаций, то по этому типу повреждений радиочувствительность разных стадий, как сперматогенеза, так и овогенеза оказывается одинаковой. Так, Лефевр не обнаружил никаких различий в радиочувствительности постмейотических половых клеток дрозофилы по тесту точковых мутаций и пришел к выводу, что радиочувствительность спермиев и сперматид по точковым мутациям одинакова. Наряду с этим выход транслокаций в сперматидах больше, чем в спермиях, в 11,6 раза, а рецессивных сцепленных с полом летальных мутаций (смесь хромосомных и точковых) – в 3,7 раза.
Группа японских исследователей при изучении на дрозофиле мутаций dumpy точкового и хромосомного происхождения неоднократно отмечала разницу в изменении частот этих типов мутаций при различных воздействиях. Так, в работах показано, что при облучении выход мутаций dumpy точкового происхождения одинаков на разных стадиях сперматогенеза у дрозофилы, в то время как индукция мутаций dumpy хромосомной природы различается.
Не обнаружено различий между зрелыми и незрелыми ооцитами по чувствительности к индукции облучением мутаций dumpy точковой природы.Установлено, что вариации в общей частоте мутаций на протяжении овогенеза обусловлены мутациями аберрантного происхождения, тогда как выход точковых мутаций мало зависит от фазы овогенеза. Эти данные полностью согласуются с данными, полученными в работе при исследовании индукции мутаций в 10 специфических локусах половой хромосомы в ооцитах и овогониях дрозофилы.
Таким образом, по тесту точковых мутаций спермии имеют практически одинаковую радиочувствительность со сперматидами, а овогонии с ооцитами, несмотря на огромную разницу в метаболизме и эффективности репарационных процессов в этих клетках.
Радиочувствительность разных линий. При изучении разных линий дрозофилы, отличающихся по своей радиочувствительности, показано, что выход точковых мутаций одинаков, а различия обусловлены лишь неодинаковой индукцией хромосомных аберраций.
Кислородный эффект. Известно, что кислород, присутствующий во время облучения, подавляет работу репарационных систем. При отсутствии кислородного влияния на выход хромосомных перестроек у линий дрозофилы, дефектных по эксцизионной и репликационной репарации, кислородный эффект является модификацией способности к репарации.
Модификация кислородом частоты радиационных мутаций показана лишь для хромосомных аберраций, а индукция облучением точковых мутаций не изменяется при воздействии кислородом или азотом. Например, по данным работы, обработка половых клеток дрозофилы азотом после облучения в кислороде повышает частоту транслокаций в этих клетках, но не изменяет выхода точковых мутаций (рецессивные летальные мутации в кольцевой Х-хромосоме). Аналогично воздействие кислородом после облучения в азоте уменьшает выход аберраций хромосом, но не влияет на индукцию точковых мутаций. При этом если выход одиночных и двойных разрывов при облучении в воздухе, азоте и кислороде различается существенно, то данные по изменению выхода поврежденных оснований при облучении в кислороде отсутствуют.
Выдерживание в кислороде после облучения в азоте способствует репарации повреждений в сперматидах дрозофилы, при этом уменьшается выход индуцированных облучением аберраций, но частота генных мутаций в специфических локусах половой хромосомы и аутосомы II не изменяется.
Влияние мощности дозы. Выход видимых мутаций и мутаций у дрозофилы изучался при облучении γ -лучами с разной мощностью дозы – 3000 и 30 рад/мин (Единицы измерений доз облучения в цитируемых работах нами не переведены в единицы СИ, так как не указано, являются ли эти дозы экспозиционными или поглощенными.). Оказалось, что частота мутаций аберрантной природы была значительно ниже при малой мощности дозы, чем при высокой, но выход точковых мутаций остался одинаковым при уровнях мощностей дозы, различающихся в 100 раз. Таким образом, индукция точковых мутаций не зависит от мощности дозы облучения.
Влияние типа излучения. Репарация повреждений, индуцированных нейтронным облучением, не обнаружена. Такие повреждения либо вовсе не репарируются, либо репарируются с большим трудом. При изучении выхода мутации у дрозофилы установлено, что ОБЭ нейтронов по сравнению с рентгеновским излучением в 2 раза выше для мутаций хромосомной природы, чем для точковых. Аналогичные данные получены и в работе.
Влияние ЭМС. Известно, что ЭМС вызывает преимущественно генные мутации. Выход генных мутаций у дрозофилы под влиянием ЭМС не модифицируется даже кофеином. Показано также, что в клетках китайского хомячка повреждения, индуцированные ЭМС, необратимы и приводят к индукции и экспрессии мутаций в отсутствие синтеза ДНК. Частота генных мутаций в локусе HPRT в клетках китайского хомячка, индуцированных этилнитрозомочевиной, не изменяется в разных послеэкспозиционных условиях, в которых снижается частота СХО. Авторы данной работы пришли к выводу, что повреждения, ведущие к СХО, в отличие от нерепарируемых мутагенных” изменений репарируются.
Влияние гена, нарушающего рекомбинацию. При исследовании влияния γ-лучей на индукцию мутаций у дефектной по рекомбинации линии дрозофилы c3G было выявлено что частота точковых мутаций в сперматоцитах мутантной и дикой линий одинакова, а индукция гиперплоидных самцов различна. Автор предполагает, что c3G ген включается в процесс индукции ионизирующей радиацией больших структурных изменений и не связан с индукцией генных мутаций.
Для всех приведенных фактов возможно лишь одно объяснение – отсутствие влияния вообще или слабое влияние репарационных систем на выход точковых мутаций.
В отличие от точковых мутаций индукция хромосомных аберраций не только эффективно изменяется под воздействием физических и химических модификаторов, но и зависит от многих факторов, зачастую не контролируемых экспериментатором. Рассмотрим основные из них.
Известно, что разные виды живых существ обладают различной радиочувствительностью. Известно также, что разные стадии и гаметогенеза, и клеточного цикла тоже обладают различной радиочувствительностью. Однако нельзя говорить о радиочувствительности вообще, так как общая радиочувствительность, определяемая по летальной или полулеталыюй дозе, не всегда коррелирует с цитогенетической радиочувствительностью разных органов, тканей и клеток, между которыми часто отсутствует корреляция по индукции хромосомных аберраций. При определении генетической радиочувствительности с помощью разных тестов можно получить противоположные результаты, так как разные стадии клеточного цикла и гаметогенеза, а также линии животных с разным генотипом и т. д. различаются по радиочувствительности, выявляемой по тесту хромосомных аберраций, но имеют одинаковую радиочувствительность по тесту точковых мутаций. Чтобы избежать получения противоречивых данных, надо учитывать специфику каждого используемого теста, а также разнообразные факторы, изменяющие или искажающие результаты оценки кластогенного действия ионизирующей радиации (равно, как и любых других мутагенов).
Генотип. Индукция облучением хромосомных перестроек существенно отличается у особей разных генотипов. Так, например, у гибридных мышей (С3Н X 101) F1 при облучении возникает более высокая частота врожденных аномалий и реципрокных транслокаций по сравнению с гибридами (SFC XС57ВL) F1. Аналогичные данные получены и при исследовании других линий мышей.
У мышей конгенных линий выявлены группы с высокой и низкой частотой возникновения хромосомных аберраций.
Межлинейные различия радиочувствительности ряд авторов связывает с неодинаковой эффективностью репарационных процессов у разных линий. В частности, различная степень восстановления ДНК в клетках млекопитающих разных линий оказалась ответственной за различия в их радиочувствительности.
Известно, что радиочувствительность клеток зависит от плоидности. Например, повышенная радиочувствительность мутанта дрожжей обнаружена лишь у диплоидов, а аналогичный гаплоидный мутант обладает такой же устойчивостью к радиации, что и дрожжи дикого типа. Такие же результаты получены японскими исследователями, при изучении мутанта дрожжей.
На цитогенетическую радиочувствительность клеток влияют даже небольшие изменения генотипа. Так, показано, что частота аберраций, индуцируемых в культивируемых фибробластах человека, значительно выше в клетках с трисомией хромосом по сравнению с диплоидными клетками, а частота транслокаций в клетках мышей с нормальным кариотипом оказалась выше, чем у мышей, гетерозиготных по транслокации.
При этом межлинейные различия по цитогенетической радиочувствительности могут не коррелировать с общей радиочувствительностью. Так, мыши линии 101/Н оказались гораздо более чувствительными в отношении вызываемой рентгеновским излучением гибели сперматогониальных клеток, чем гибриды, но в то же время уровень транслокаций у мышей 101/Н оказался существенно ниже.
Тканевая специфичность. Сравнение радиочувствительности по тесту хромосомных перестроек затрудняется тем, что нет корреляции между различной частотой аберраций у разных линий и в клетках разных тканей животных, т. е. линия, более чувствительная к индукции перестроек в каких-то соматических клетках, оказывается устойчивой к индукции аберраций в половых клетках, и наоборот. Так, в работе показано, что относительная радиочувствительность мышей четырех генотипов, определяемая по выходу хромосомных перестроек в сперматоцитах, обратна таковой в клетках роговицы глаза.
По данным работы, при рентгенооблучении мышей в дозе 400 рад в костном мозге возникает в 4,2 раза больше аберраций, чем в сперматоцитах. Предполагалось, что причинами этого различия являются разные методы определения хромосомных перестроек в указанных тканях, а также неодинаковая элиминация и пролиферация клеток, несущих аберрации, в пострадиационный период. В ней указывалось на отсутствие корреляции между чувствительностью этих тканей по тесту хромосомных аберраций и по клеточной гибели, что приводит к выживанию клеток с перестройками в разных тканях. Сравнительное изучение хромосомной радиочувствительности лимфоцитов крови и сперматогониальных клеток у мыши и макаки-резуса было продолжено в работе. Полученные результаты позволили сделать вывод об отсутствии фиксированного соотношения между частотой индуцированных радиацией аберраций в соматических и половых клетках. Поэтому авторы считают, что при определении степени генетического риска воздействия облучения на человека решающую роль должна играть прямая оценка частоты мутаций в половых клетках.
Сравнение радиочувствительности лейкоцитов периферической крови и сперматогониальных клеток у мышей и китайского хомячка показало, что частота хромосомных обменов, индуцированных радиацией в половых клетках, ниже, чем в лейкоцитах. Обнаружено также что частота аберраций, вызываемая облучением в роговице глаза, больше, а в печени меньше, чем в половых клетках.
Кроме причин, обусловливающих разную индукцию аберраций в разных тканях организма, большую роль играют и различия в эффективности репарационных систем. Показано, например, что в клетках млекопитающих репарационные энзимы обладают неодинаковой активностью в тканях разных органов.
Возраст и пол. Известно, что цитогенетическая радиочувствительность увеличивается по мере старения организма. Однако влияние возраста на индукцию мутаций не всегда однозначно. Так, уровень реципрокных транслокаций и фрагментов хромосом у мышей значительно возрастает с увеличением возраста от 75 до 850 дней, а частота гипергаплоидных и анеуплоидных клеток не изменяется.
У старых облученных самок мыши частота аберраций в 3 раза выше, чем у молодых. Интересно, что при этом играет роль репродуктивный статус самок – после облучения старых девственных самок они давали помет меньшего размера, чем повторнородящие самки того же возраста.
Возрастные различия в повреждаемости хромосом выявлены и для культивируемых клеток человека, и для клеток печени плода мышей.
Увеличение частоты индуцированных мутаций при старении можно объяснить нарушением репарационных процессов. Эффективность систем восстановления весьма лабильна, она различна в клетках с разным уровнем метаболизма и может быть подвержена воздействию самых разнообразных факторов, с которыми соприкасается организм в течение жизни. Эффективность систем репарации изменяется с возрастом, а также имеет видовую, органную и тканевую специфичность.
Хорошо известны и различия в работе репарационных систем у особей разного пола. Например, в сперматозоидах дрозофилы ферменты репарации отсутствуют, а повреждения, возникающие в этих клетках, репарируются после оплодотворения за счет репарационных ферментов самки. Однако различный выход структурных мутаций в клетках у особей разного пола может определяться и разной чувствительностью этих клеток к облучению.
Специфика стадий клеточного цикла и гаметогенеза. Радиочувствительность разных стадий клеточного цикла по тесту хромосомных перестроек неодинакова что обусловлено не различной чувствительностью самого генетического материала, а разной эффективностью репарационных процессов на этих стадиях.
Еще в 1975 г. Н. В. Лучник писал, что на всех стадиях цикла мишень имеет одну и ту же природу. Радиация вызывает одно и то же или примерно одно и то же число потенциальных повреждений, и природа этих повреждений также одна и та же. На всех стадиях клеточного цикла одинакова и возможность репарации.
Аналогичные выводы сделаны и в ряде других работ в которых отмечается, что различия в выходе структурных повреждений хромосом обусловлены разным вкладом репарации.
Однако, кроме различий в эффективности репарационных процессов, протекающих на разных стадиях клеточного цикла, на индукцию облучением хромосомных перестроек может влиять длительность протекания одной и той же стадии. Так, при сравнении радиочувствительности нейробластов двух линий кобылок, имеющих периоды клеточных циклов 2 и 4 ч, было показано, что значительно большее число фрагментов хромосом возникает в клетках с четырехчасовым циклом. Авторы связывают это явление с тем, что при данной дозе облучения начальное индуцирование у клеток с четырехчасовым циклом больше, чем у клеток с двухчасовым циклом, хотя кривые митотического восстановления одинаковы у обеих линий.
Хорошо известна различная радиочувствительность по тесту хромосомных перестроек разных стадий гаметогенеза. Одной из причин этого явления служит большая степень селекции предмейотических клеток с нарушением хромосом по сравнению с постмейотическими. Что же касается последних, то, безусловно, главную роль в изменении выхода структурных мутаций играют различия в эффективности репарационных процессов, протекающих в клетках разной степени зрелости. В экспериментах с четырьмя линиями дрозофилы, в том числе с нарушенными системами репарации ДНК, изучалась чувствительность разных стадий оогенеза к рентгеновскому излучению и экспериментально показано, что работа систем репарации ДНК стадиеспецифична.
Поскольку стадии клеточного цикла и гаметогенеза имеют неодинаковую радиочувствительность по тесту перестроек хромосом, то при обработке клеток необходимо учитывать, не вызывает ли применяемый агент сдвиг стадий.
Многие физические и химические факторы вызывают изменения в скорости митотического цикла, при этом разные клетки вступают в метафазу в разное время после обработки. Это приводит к тому, что сравниваются метафазы клеток, прошедшие разное количество делений и имеющие разную частоту аберраций, так как частота аберраций уменьшается с каждым последующим делением. Например, при обработке лимфоцитов мутагеном и протектором с помощью метода „арлекиновой” окраски хромосом установлено, что при фиксации лимфоцитов через 54 ч от начала культивирования лишь 25,5 % клеток находятся в первом митозе, а 73,5 % – во втором. При этом протектор не влиял на частоту аберраций, индуцированных в клетках первого митоза, но уменьшал число аберрантных клеток, вступивших во второй митоз, деление которых протекает быстрее. Эксперименты с 3Н-тимидином показали, что часть клеток второго митоза во время добавления мутагена находилась в С2-стадии клеточного цикла, а, следовательно, снижение частоты аберраций при действии протектора перед добавлением мутагена может быть артефактом клеточной селекции.
Таким же артефактом оказался кажущийся синергизм дальнего красного света и рентгеновского излучения. Красный свет замедлял протекание клеточного цикла, и после обработки им действие рентгеновских лучей приходилось на клетки, оказавшиеся в самой чувствительной стадии.
Установлено, что введение в организм или культуральную среду 3Н-тимидина приводит не только к задержке вступления клетки в митоз, но и перескакиванию из G2-фазы в G1 или G0 следующего митоза, к уменьшению периода деления клетки, гибели клеток, индукции хромосомных перестроек и т. д. Все это может привести к самым неожиданным и противоречивым результатам при исследовании выхода структурных мутаций под действием ионизирующей радиации (равно, как и любого другого мутагена), и особенно при изучении совместного действия двух и более факторов.
Размер (дифференцировка) клетки. Существует две субпопуляции лимфоцитов – большие и малые. Лимфоциты большого размера устойчивы к облучению, а малые чувствительны. В процессе дифференцировки лимфоциты в значительной степени утрачивают способность к эксцизионной репарации. Обусловлено это тем, что при дифференцировке клетки возрастает спирализация и плотность упаковки ДНК, что препятствует доступу ферментов репарации к месту повреждения. При обработке клеток ФГА, который обычно используется при культивировании лимфоцитов, происходит дедифференцировка клеток, вследствие чего возрастает и их устойчивость к облучению. Лимфоциты людей, больных красной волчанкой, теряют свою суперспирализацию, и поэтому в них лучше репарируются повреждения, ведущие к хромосомным перестройкам или гибели клеток. Все это приводит к различному выходу аберраций хромосом при тестировании кластогенного действия мутагенных факторов.
Диаметр и специфичность хромосомы. Радиочувствительность клеток, как оказалось, зависит и от диаметра хромосом пронуклеуса. Такой вывод был сделан на основании изучения двух популяций комаров, одна из которых обитает в Альпах, а другая – в Берлине. Частота перестроек у этих популяций различалась в 10-20 раз и коррелировала с числом витков в хромосомной спирали. По мнению автора, повышенная радиочувствительность клеток с большим числом витков в хромосомной спирали объясняется тем, что каждый виток является единицей внутри- и межхромосомных контактов, ведущих к возникновению аберраций хромосом. Нам представляется возможным и другое объяснение: чем более спирализована ДНК (большее число витков), тем труднее осуществляется репарация потенциальных повреждений и выше выход структурных мутаций. Интересно, что по общей радиочувствительности эти популяции различались в 1,5 раза, что свидетельствует об отсутствии корреляции между общей и цитогенетической радиочувствительностью.
На индукцию хромосомных перестроек влияет не только величина диаметра хромосом, но и другие характеристики.
Существует мнение, что частота образования структурных мутаций в хромосомах пропорциональна их длине. Действительно, чем хромосома длиннее, тем вероятнее в ней и возникновение первичных повреждений, и формирование хромосомных перестроек. Однако обнаружено что в разных парах хромосом частота образования аберраций различается и при этом не соответствует длине хромосомы.
К такому же выводу пришли, и японские исследователи при изучении с помощью Q- и R-окрашивания хромосомных перестроек, возникающих в костном мозге крыс и мышей после v-облучения. Они показали, что частота аберраций в индивидуальных хромосомах распределена не случайным образом. Были выделены более ранимые и более резистентные хромосомы, причем было установлено, что эти показатели не коррелируют с длиной хромосом. Особенно интересно, что среди чаще всего поражаемых хромосом мыши и крысы три пары оказались гомеологичными.
К выводу о неравномерности распределения хромосомных повреждений во фракциях метафазных хромосом, различающихся по размеру, пришли и другие авторы.
Чувствительность участков внутри хромосомы. Все исследователи, изучавшие локализацию индуцированных хромосомных перестроек, отмечали неравномерность распределения разрывов по длине хромосомы. Это явление обычно связывают с распределением эу- и гетерохроматина, структурная организация и биохимическая дифференциация которых различны. Показано, что при различных воздействиях (ионизирующая радиация, химические вещества, температурная обработка) повреждения хромосом локализуются преимущественно в гетерохроматиновых районах хромосомы. Однако, несмотря на то, что аберрации хромосом в большей степени локализованы в гетерохроматиновых участках или на стыках гетеро- и эухроматина, эухроматин сильнее подвержен прямому действию повреждающих агентов (ионизирующая радиация, канцерогенные химические соединения, ДНКаза I и т. д.).Такое противоречие может быть связано с тем, что относительное количество первичных повреждений существенно выше в эухроматине, чем в гетерохроматиновых участках, но в последних затруднены процессы репарации.
Кроме того, были установлены и причины неравномерного распределения аберраций по длине хромосом. Так, в работе отмечено, что «горячие» точки у многих видов выявляются в позднореплицирующемся гетерохроматине. На распределение хромосомных перестроек влияют также: 1) тип используемого мутагена; 2) относительное положение участка внутри кариотипа; 3) наличие структурных перестроек хромосом до воздействия; 4) число потенциальных „горячих” сегментов на хромосому и т. д.
Используя предложенную Касперсоном окраску акрихин-ипритом, с помощью флуоресцентного микроскопа Холмберг установил, что разрывы хромосом лимфоцитов человека под действием облучения возникают преимущественно в К-областях хромосом, и частота разрывов в каждой хромосоме пропорциональна длине этих участков. При этом оказалось, что структурные изменения хромосом не затрагивают С-областей.
Интересно, что существуют отдельные особенно „ломкие” участки хромосом, причем они специфичны для разных генотипов. Например, при изучении двух инбредных генетически чистых линий мышей для одной из них были обнаружены 3 „ломких” участка (12А2,15А2,19А2), а для другой – один (19В). Частота клеток с „ломкими” участками 15А2 и 19В увеличивалась при добавлении ФУДР. Существует мнение, что разрывы хромосом происходят в результате не только специфического биохимического действия мутагена, но и биофизических или физико-химических напряжений.
Сроки воздействия и фиксации. Результаты определения уровня хромосомных перестроек в соматических клетках существенно искажаются при длительном воздействии мутагенных факторов. Одной из причин этого является элиминация короткоживущих клеток, вместе с которыми элиминируются и перестройки. Тем более что вероятность гибели клеток с повреждениями выше, чем нормальных. Вторая причина – это гетерогенность клеток по чувствительности к мутагенам. Так, отмечено что популяции лимфоцитов обладают разной чувствительностью, причем чувствительная субпопуляция активно элиминируется и приводит к снижению клеток с хромосомными нарушениями. При длительных воздействиях мутагенных агентов происходит адаптация популяций к этим мутагенам. Популяции становятся более резистентными, что также приводит к существенному занижению результатов оценки генетической опасности мутагенных факторов по сравнению с результатами исследования однократных мутагенных воздействий.
Необходимо учитывать и тот факт, что с увеличением сроков культивирования клеток в них нарастает асинхронизация. Так, даже в синхронизированной культуре лимфоцитов человека уже через 5 ч культивирования появляются клетки второго деления, через 48 ч образуется смесь клеток двух делений, а через 80 ч – пяти делений.
При облучении гепаринизированной цельной крови индийских мунтжаков через 48 ч культивирования обнаружена разная частота хромосомных аберраций в метафазах 1,2 и 3-го митозов. Автором установлено, что 50 % дицентриков и 12% колец переносится из первого цикла во второй. В первом цикле после облучения в дозе 4 Гр было найдено 94 % аномальных клеток, а во втором – 73 %. После третьего цикла частота хромосомных нарушений существенно снижается. Эти данные неоспоримо свидетельствуют о том, что нельзя изучать количественные закономерности индуцирования цитогенетических повреждений в клетке без идентификации первого и последующих клеточных делений.
Роль условий проведения опытов. На результаты цитогенетических исследований могут оказывать влияние условия проведения опыта. Например, в лимфоцитах периферической крови человека был обнаружен „эффект хранения”. Для изучения его влияния на частоту аберраций хромосом были проведены исследования в двух вариантах. В первом варианте обработанные мутагеном лимфоциты стимулировали к делению с помощью ФГА и БДУ в течение 0-9 дней, а во втором варианте опытов ФГА и БДУ добавляли в культуру клеток сразу же после обработки мутагеном. Оказалось, что в обоих вариантах опытов частота хромосомных перестроек хроматидного и хромосомного типа интенсивно увеличивалась вплоть до последнего срока культивирования, в то время как частота СХО возрастала постепенно, достигая максимума на 6-й день, а затем начинала снижаться. Установлено, что на частоту аберраций в лимфоцитах влияют не только сроки хранения, но и температура хранения и посуда, в которой хранилась кровь перед облучением. Так, в клетках крови, хранившейся при t = 5°С в течение 173ч в пластиковых сосудах, после облучения частота аберрантных клеток была в 2 раза больше, чем в лимфоцитах свежей крови. Статистически значимое увеличение уровня хромосомных перестроек наблюдалось и при хранении крови до облучения в течение 24, 48 и 72 ч при t = 5, 20 и 37 °С. Однако хранение крови в течение 48 ч при t = 20 °С в стеклянных сосудах не повышало частоты аберраций по сравнению со свежей кровью. Был сделан вывод о сенсибилизирующем действии пластмассы на наследственные структуры лимфоцитов.
Возможны и другие артефакты, влияющие на результаты генетических исследований. Так, в работе указывается, что размер проб, количество повторностей, выбор метода статистической обработки данных, а также экспериментальные артефакты и случайные ошибки могут быть причинами противоречивости данных, получаемых в разных лабораториях при исследовании одного и того же генотоксического агента. Например, к артефактам может привести также отсутствие тщательной отмывки культуры. В некоторых опытах даже показатели осмотического давления, концентрация ионов и рН среды влияли на результаты цитогенетических исследований.
Таким образом, на индукцию хромосомных перестроек в отличие от точковых мутаций влияют самые разнообразные факторы. Зависимость уровня структурных мутаций от многообразных клеточных характеристик свидетельствует о том, что образование аберраций тесно связано с метаболическими процессами в клетке, и в частности с репарационными.
Различия в индукции хромосомных и точковых мутаций, очевидно, связаны с их разной природой и разными путями становления. Так как точковые мутации – это изменения на уровне нуклеотидов ДНК, не затрагивающие белковый компонент нуклеопротеида и не нарушающие в процессе своего формирования целостность хромосомы, а для образования структурных перестроек обязательны разрыв в сахарофосфате и участие белкового компонента, то и возможности для репарации предмутационных повреждений при образовании точковых и структурных мутаций различны.
Исследования роли белково-нуклеиновых взаимодействий в репарации ДНК в клетках эукариот начаты недавно, но влияние состояния хроматина на репарацию ДНК не вызывает сомнений. В частности, установлено, что кинетика репарации на уровне ДНК и хромосом после γ-облучения совершенно различна Это объясняется тем, что доступ ферментов репарации к ДНК в составе хроматина ограничен. Так, по данным структурное состояние хроматина влияет на распределение репаративного синтеза не только на уровне нуклеосом, но и на более высоких уровнях его упаковки, а по данным работы доступ нуклеазы к ДНК ограничен гистоновой сердцевиной с одной стороны и прилегающим витком суперспирали ДНК – с другой. Установлено также, что изменение организации хроматина в интерфазном ядре приводит к нарушению репарационных процессов, причем упаковка ДНК в эу- и гетерохроматине хромосом находится под разным генным контролем. В некоторых случаях особенности строения хроматина могут ограничивать репарацию ДНК (например, в нестимулированных лимфоцитах и высокодифференцированных клетках хрусталика глаза). По данным работы плотная упаковка хроматина препятствует репарации радиационных повреждений, что способствует развитию индуцированных ядерных пикнозов. В ней приводятся факты зависимости радиочувствительности от структурных и топологических особенностей организации хроматина в интерфазных клетках и высказывается мнение, противоположное устоявшемуся в радиобиологии, о том, что радиочувствительность клеток пропорциональна объему интерфазных хромосом. В то же время при постоянном количестве ДНК радиочувствительность обратно пропорциональна объему ядра. Например, объем ядер радиочувствительных лимфоцитов колеблется от 20 до 65 мм3, тогда как для клеток печени ядерный объем достигает нескольких тысяч. Другими словами, радиочувствительность клетки прямо пропорциональна плотности упаковки ДНК при постоянном ее количестве.
Процесс созревания хроматина сопровождается повышением устойчивости ДНК к нуклеазам. На разных стадиях мейоза хроматин в различной степени защищен от воздействия нуклеаз, однако, по данным [Строков А.А., 1982г.], эта устойчивость не пропорциональна степени конденсации хроматина. Следовательно, кроме плотности упаковки есть и другие факторы, затрудняющие доступ нуклеаз к ДНК.
Отмечено также, что поли (АДФ) рибозилирование хроматина имеет функциональное значение для репарации ДНК, вызывает ослабление белково-нуклеиновых взаимодействий в участках репарации ДНК и обеспечивает их доступность для ферментов эксцизионной репарации. В работе описан антимутаген ПАЕ, эффективность которого объясняется тем, что он делает ДНК доступной для ферментов репарации. И наоборот, ингибиторы топоизомераз новобиоцин и налидиксовая кислота предотвращают релаксацию суперспирализованной ДНК, что приводит к ингибированию начального этапа репарации.
Следовательно, повреждения на уровне нуклеотидов могут быть недоступными для ферментов репарации, так как защищены „белковым футляром” Повреждения репарабельны или нерепарабельны в зависимости от их локализации. Очевидно, часть изменений нуклеотидов ускользает от репарации: они либо не узнаются репарационными ферментами, так как не нарушают вторичную структуру молекулы, либо прикрыты белком и недоступны для репарационных ферментов. Например, не удалось зарегистрировать репарации метилированных пуринов в ДНК из экстрактов эмбрионов дрозофилы. Авторы предполагают, что отсутствие ДНК-гликозилазной активности у дрозофилы свидетельствует о недостаточности системы эксцизионной репарации для удаления модифицированных оснований в ДНК. Известно, что после хронического облучения экспериментаторы фиксируют меньшее количество индуцированных мутаций, чем после острого. Объясняется это тем, что при длительном облучении с малой мощностью дозы системы восстановления имеют больше времени и возможностей для репарации возникающих предмутационных повреждений. Например, при хроническом УФ облучении в конидиях нейроспоры возникает в 4-7 раз меньше мутаций, чем при остром.
Установлено, что при хроническом облучении у нейроспоры образуются исключительно точковые мутации, а не мультигенные делеции, как при остром. Такие точковые мутации названы „устойчивыми к репарации” и показано, что величина эффекта „доза – время облучения” (частота мутаций при остром облучении, деленная на частоту мутаций при хроническом облучении при равной общей дозе) различна для отдельных сайтов. Этот факт указывает на то, что точковые мутации могут быть связаны с определенными нуклеопротеидами или конфигурацией ДНК.
О том, что точковые мутации могут формироваться без участия репарационных ферментов, свидетельствует и работа. Авторами обнаружены вставки Р-транспозонов в сайтах мутаций, индуцированных при синдроме дисгенезиса у гибридов дрозофилы, и исследовано влияние нарушений систем репарации ДНК (пострепликативной и эксцизионной) у разных линий дрозофилы на активность Р-транспозонов. Оказалось, что нарушения одного или двух путей репарации не влияют на транспозицию Р-элементов. Был сделан вывод о том, что Р-транспозоны функционируют независимо от систем репарации ДНК и сами кодируют продукты, необходимые для осуществления процесса их транспозиции, так же, как и мобильные элементы прокариот и низших эукариот.
Связь с репарацией
Согласно современным представлениям о функционировании репаративных систем в клетках эукариот отдельные биохимические реакции репарации ДНК протекают не независимо, а взаимосвязанно и некоторые из них позволяют клетке функционировать, несмотря на присутствие повреждения, причем синтез ДНК может идти „в обход» нерепарированных повреждений.
Очевидно, этим и объясняются факты отсутствия репарации в клетках млекопитающих, обнаруженные в ряде работ. Так, в работе показано, что в некоторых линиях животных клеток димеры не вырезаются. В работе отмечается, что клетки почти всех млекопитающих вообще лишены фотореактивирующего фермента. В то же время в исследовании делается вывод о том, что в клетках роговицы глаза возникают „не фоторепарируемые поражения”, хотя тесты in vitro (при экстракции ДНК из этих же клеток) показыва