Лекция (мультимедиа)
Микроорганизм – специфический элемент биотехнологических систем.
Метаболизм, закономерности роста и развития микроорганизмов.
Получение экзо- и эндо- метаболитов.
(Слайд 1)
Содержание (Слайд 2)
Введение.
1. Строение бактериальной клетки.
2. Координация микробного метаболизма.
3. Закономерности роста и развития микроорганизмов.
4. Методы получения и совершенство-вания производственных штаммов микроорганизмов.
Заключение.
Литература (Слайд 3)
1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М.: Мир, 2000.
2. Кантере В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств.- М.: ВО «Агро-промиздат», 1990 г.
3. Самуйленко А. Я., Рубан Е. А. Основы биотехно-логии производства биологических препаратов.- Т 1, Т 2. – М., 2000.
4. Тихонов И.В., Рубан Е.А., Грязнева Т.Н. и др. Биотехнология.- Спб.- Гиорд.-2005.-790 с.
5. Тутов И.К., Ситьков В.И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов.- Ст. ГСХА, 1997.
Введение
(Слайд 4) Чтобы получить какой-либо биотехнологический продукт (вакцина, сыворотка, диагностический препарат, антибиотик, фермент, витамин и др), необходимы 4 основных элемента.
Важнейшей особенностью биотехнологического процесса является то, что реакции образования или разрушения различных продуктов осуществляются с помощью живых микроорганизмов. Они потребляют из окружающей среды вещества, растут, размножаются, выделяют жидкие и газообразные продукты метаболизма. Тем самым реализуются те изменения в живой системе (накопление биомассы или продуктов метаболизма, потребление загрязняющих веществ), ради которых проводят процесс культивирования, (Слайд 5) т.о. культуру микроорганизмов можно рассматривать как центральный элемент биотехнологической системы, определяющий эффективность ее функционирования. (Слайд 6). Остальные элементы системы культивирования (ферментатор-культиватор, питательная среда, система контроля и управления и др.) подбирают или коструируют так, чтобы в максимальной степени обеспечить потребности применяемой культуры и стимулировать их функционирование в желаемом направлении.
Поскольку для ветеринарии производятся, в основном, противобактериальные и протиовирусные препараты, в данной лекции мы сконцентрируем внимание на бактериях-продуцентах как специфическом элементе биотехнологических систем, а вирусы рассмотрим в последующих лекциях курса, притом, что вирусы ничего не продуцируют, а только размножаются, и сегодня вспомним строение вирусов.
(Слайд 7) Выбор бактерий, как основного элемента биотехнологических систем обусловлен следующими факторами:
1. Клетки являются своего рода “биофабриками”, вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр. Многие из этих продуктов, крайне необходимые в жизни человека, пока недоступны для получения “небиотехноло-гическими” способами из-за дефицитности или высокой стоимости сырья или же сложности технологических процессов, особенно их использования в крупномасштабном производстве;
2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 мин., дрожжевая - через каждые 1,5-2 часа, животная - через 24 часа, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешёвых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток. Например, в ферментёре (аппарате для выращивания клеток) ёмкостью 100 м3 за 2-3 суток можно вырастить 1016 - 1018 микробных клеток. В процессе жизнедеятельности клеток при их выращивании в среду поступает большое количество ценных продуктов, а сами клетки представляют собой кладовые этих продуктов;
3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др. значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. При этом исходное сырьё для биосинтеза, как правило, проще и доступнее, чем сырьё для других видов синтеза. Для биосинтеза используют отходы сельскохозяйственной, рыбной продукции, пищевой промышленности, растительное сырьё(например, молочная сыворотка, дрожжи, древесина, меласса и др.);
4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования, доступность сырья, технологии переработки и т.д.
(Слайд 8) Бактерии относятся к прокариотам (безъядерным (предъядерным) организмам)), в их клетках нет дифференцированного ядра. Подавляющее большинство используемых в промышленности бактерий-гетеротрофы; они нуждаются в органических источниках углерода и энергии. (Слайд 9).
(Слайд 10) Бактерии представляют собой одноклеточные микрооганизмы, имеющие шарообразную форму (кокки) или цилиндрическую (палочки): палочки бывают прямые и изогнутые. Бактерии размножаются путем бинарного деления, при котором образуются две одинаковые клетки.
(Слайд 11) В микробиологической промышленности бактерии применяют, в основном, для получения вакцин, продуктов микробного синтеза (ферментов, органических кислот, антибиотиков и др.), средств защиты (растений) и т.д.
(Слайд 12, 13, 14, 15) Вирусы.
Вспомним строение бактериальной клетки.
Вопрос 1. Строение бактериальной клетки
(Слайд 16) Из курса микробиологии, вы хорошо представляете строение бактерий, поэтому вспомним об основных клеточных структурах, участвующих в процессах биосинтеза.
(Слайд 17) Микробная клетка покрыта снаружи клеточной стенкой. Клеточная стенка у бактерий прочная и эластичная, как покрышка футбольного мяча. Подобно тому, как мячу придаёт упругость надутая камера, клеточной стенке придает определенную упругость внутреннее содержимое клетки, окруженное цитоплазматической мембраной.
Клеточная стенка выполняет следующие функции:
1. Выполняет роль механического барьера. Защищает клетку от воздействий внешней среды, участвует в делении, придает клетке характерную форму, поддерживая в ней осмотическое давление.
2. Участвует в транспорте питательных веществ и метаболитов за счет того, что она проницаема для солей и других низкомолекулярных соединений, а через поры размером до 3,6 мкм, которые в ней имеются, проникают высокомолекулярные биополимеры.
3. На поверхности клетки находятся рецепторы для фагов, бактериоцинов и др.
4. Структура и состав клетки определяют антигенную характеристику (Оi, Vi-антигены), а также отношение к красителям (Гр+, Гр-).
5. Нарушение целостности клеточной стенки ведет к гибели клетки или образованию L-форм и т.д.
(Слайд 18) Химический состав клеточной стенки бактерий уникален и состоит из пептидогликана (муреина), который представляет собой N-ацетил-Д-глюкозамин и N-ацетилмурамовую кислоту и специфические пептиды. Клеточная стенка, ответственна также за окрашивание по Граму. Способность или, наоборот, неспособность окрашиваться в темно-фиолетовый цвет при использовании метода, предложенного в 1884 г. Грамом, служит важным таксономическим признаком, с которым коррелируют другие свойства бактерий.
Грамположительные бактерии отличаются от грамотрицательных:
1. По толщине муреиновой сетки - 40 слоев (30-70 % сухой массы);
2. Вместо мезодиаминопелилелийновой кислоты содержится 22-диаминопи-лелиновая кислота лизин;
3. Наличие тейхоевых кислот — цепи, состоящие из 8 — 50 остатков глицерола или рибитола связанных между собой фосфатными частицами, которые через фосфат связаны с муреином по типу амида.
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) — тонкая (7-8 мкм) мембрана, расположенная под клеточной стенкой и отделяющая ее - от цитоплазмы. Ц.п.мл состоит из биомолекулярного слоя липидов, в которой включены белковые молекулы (т.н. мозаичная модель структуры мембраны). Липиды ориентированны неполярными концами внутрь, друг к другу, а полярными - наружу. Основные функции цитоплазматической мембраны следующие:
1. Играет важнейшую роль в обмене веществ, регулируя поступление веществ в клетку и обратно.
2. Является осмотическим барьером;
3. Транспорт веществ через ЦПМ осуществляется не только путем обычной молекулярной диффузии (по градиенту концентрации). Вещества могут поступать в клетку и против градиента концентрации. Например, аминокислоты легко проникают из среды в клетку, даже если их концентрация в цитоплазме в 100-200 раз выше, чем в окружающей среде. Имеются механизмы активного транспорта, в которых участвуют специальные факторы.
4. ЦПД пронизана «мостиками» или каналами из белков и именно они служат порами, через которые осуществляется регулируемый транспорт веществ.
5. Участие в процессе дыхания — на поверхности или внутри ЦПМ располагаются ферменты (например, цитохром расположен в наружном слое, а АТФ — синтетаза — на внутренней стороне мембраны).
6. Участие в процессе движения - т.к. жгутики прикреплены к ЦПМ.
7. Участие в формировании капсулы и делении клеток (образование первичной перетяжки при делении клеток).
(Слайд 19) Цитоплазма — основная масса клетки. Она заключена в оболочки клетки и представляет собой коллоидный раствор аминокислот, ферментов, углеводов, минеральных солей и многих других веществ в воде.
Нуклеоид — место в бактериальной клетке, где располагается двухцепочечная кольцевая ДНК и связанные с ней белки. Обеспечивает хранение и передачу генетической информации. ДНК при делении клеток удваивается (реплицируется) и с неё транскрибируется информация на м-РНК.
Рибосомы - шаровидные структуры размером 15-35 мкм - содержат р-РНК и белковый комплекс. На рибосомах протекает синтез белков, т.е. информация, записанная в ДНК в виде последовательности нуклеотидов, транслируется в последовательность аминокислот в молекуле белка.
Вакуоли и гранулы - в них запасаются резервные вещества клетки, чаще всего в виде валютина, жиров или углеводов.
Плазмиды – кольцевые молекцлы ДНК, в которых закодирована информация о 1-3 свойствах клетки. Есть только у бактерий.
(Слайд 20) Отличия эукариот от прокариотов.
Вопрос 2. Координация микробного метаболизма
(Слайд 21) В живых клетках протекает огромное число реакций, необходимых для роста, размножения и поддержания их жизнедеятельности. Большинство этих реакций носит ферментативный характер и протекает в присутствии специфических ферментов. Для нормального функционирования клетки необходима согласованность протекания всех реакций во времени и в пространстве. В каждый момент должны образовываться и действовать ферменты, которые катализируют реакции, нужные в данный момент развития клетки.
Практически все гены у бактерий функциональные, а у эукариот 2/3 не функциональные. Белок у бактерий синтезируется сразу весь и включается в метаболизм, а у эукариот образуются экзоны и интроны.
(Слайд 22) Координация микробного метаболизма осуществляется с помощью следующих механизмов регуляции:
1. Индукция синтеза ферментов;
2. Репрессия синтеза ферментов;
3. Ингибирование активности ферментов;
4. Активизация ферментов.
Первые два механизма обеспечивают регуляцию путем изменения концентрации того или иного фермента в клетке, вторые два — путем изменения активности уже имеющихся ферментов. Остановимся на каждом механизме подробнее.
Индукция синтеза ферментов
Все ферменты микробных клеток можно разделить на две группы:
1. Конструктивные
2. Индуцибельные.
К первой относятся ферменты, которые всегда имеются в клетке, независимо от фазы её развития и условий окружающей среды. Это ферменты, катализирующие наиболее важные метаболические реакции, например, катаболизм глюкозы.
Вторая группа включает ферменты, которые синтезируются лишь в определенных условиях, при наличии в среде вещества — индуктора. Чаще всего ин-дуктором синтеза фермента является его специфичный субстрат, но иногда может быть и другое вещество. Механизм индукции не позволяет транжирить энергию и питательные вещества на синтез ненужных, в данных условиях, ферментов.
Например, если клетки бактерий растут на среде с глюкозой, они почти не синтезируют амилолитические ферменты, однако при переносе на среду, где единственным источником углерода и энергии является крахмал, происходит индукция синтеза амилаз, необходимых для усвоения крахмала.
(Слайд 23) Наиболее подробно изучен механизм индукции синтеза ферментов (катаболизм лактозы) у Е.сoli.
Три гена, кодирующие аминокислотную последовательность трех ферментов катаболизма лактозы (В-галактозидазы, лактопермеазы и трансацетилазы), расположены в хромосоме последоватеьно и образуют совместно с промоторной и операторной областью lac-оперон.
В начале оперона, перед структурными генами, расположены регуляторный участок молекулы ДНК, состоящий из промотора и оператора.
Промотр - это участок, к которому присоединяется РНК- полимераза (начало синтеза м-РНК).
Оператор – это участок, с которым связывается специальный белок - репрессор.
Синтез репрессора, в свою очередь, кодируется геном - регулятором. Белок - репрессор содержит два активных центра - один обеспечивает присоединение белка к оператору, а другой обладает сродством с молекулами индуктора.
(Слайд 24) В отсутствие индуктора белок - репрессор прочно связывается с оператором. Это препятствует продвижению РНК-полимеразы по нуклеотидной цепочке ДНК и блокирует транскрипцию структурных генов и синтез соответствующих ферментов. При наличии индуктора (для lac - оперона - это не сама лактоза, а аллолактоза) он (индуктор) специфично присоединяется к репрессору и изменяет его конформацию, что приводит к снижению сродства репрессора к оператору и освобождению оператора. Снимается блокировка продвижения РНК-полимеразы, начинаются транскрипция структурных генов и синтез ферментов.
Описанный выше механизм индукции, при котором один индуктор вызывает синтез нескольких ферментов одного метаболического пути, называют координированной индукцией. Наряду с ней в клетках микроорганизмов действуют системы последовательной индукции. При этом длина цепочки индуцируется своим собственным субстратом (субстратом для первого фермента в цепочке).
Репрессия синтеза ферментов - это процесс, осуществляющийся по принципу обратной связи. Это означает, что конечный продукт цепи биохимических реакций подавляет синтез действия фермента, катализирующего первую реакцию цепи. Подобный механизм обеспечивает равновесие между скоростями синтеза низкомолекулярных соединений и их расходования на построение биополимеров и исключает непродуктивные затраты веществ и энергии на образование излишних количеств промежуточных продуктов.
Репрессия - подавление синтеза ферментов осуществляется следующим образом. Регуляторный ген R кодирует синтез белка-репрессора (анорепрессора), который в свободном состоянии неактивен, но может быть активирован корепрессором, который и является конечным продуктом цепи биохимических превращений.
Активированный белок-репрессор связывается с геном-оператором О, что препятствует считыванию информации со структурного гена R и, следовательно, синтезу соответствующего фермента. В отсутствие корепрессора синтез фермента происходит беспрепятственно.
Если мы добавим в питательную среду какой-либо индуктор целевого вещества (Слайд 25), то происходит сверхсинтез этого вещества, в количествах, многократно превышающих потребности самой клетки. Это явление широко используется на практике при производстве биологически активных веществ (аминокислот, витаминов, ферментов)