Испытание проводят на здоровых белых мышах обоего пола массой
19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний.
За 24 ч до испытания и во время его проведения животные должны
находиться в помещении с постоянной температурой. За 2 ч до
взвешивания и отбора животных для проведения испытаний у них
отбирают корм и воду.
Каждую серию препарата испытывают на 5 мышах. Растворитель,
концентрация раствора (тест - доза) и способ введения указаны в
частных статьях.
Раствор препарата, подлежащего испытанию, подогревают до 37
град. С и в объеме 0,5 мл вводят в хвостовую вену мыши со
скоростью 0,1 мл/с, если в частной статье нет других указаний.
Если в частной статье предусмотрен иной путь введения
препарата мышам, объем раствора, вводимого в брюшную полость, под
кожу или в желудок, может быть увеличен до 1 мл. Введение в
желудок производят шприцем посредством инъекционной иглы, на конце
которой имеется наплавленная олива, или при помощи другого
приспособления, обеспечивающего поступление раствора или взвеси
препарата в желудок.
Наблюдение за животными ведут в течение 48 ч, если в частной
статье нет других указаний.
Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение
предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна из
подопытных мышей.
В случае гибели одной мыши опыт повторяют на 5 мышах массой 20
+/-0,5 г; в случае гибели при первоначальном испытании двух мышей
повторное испытание проводят на 15 животных. Если при повторном
испытании ни одна мышь не погибнет, т.е. суммарная гибель животных
в двух опытах не превысит 10%, препарат считается выдержавшим
испытание. В противном случае препарат бракуют.
Для испытания на токсичность отбирают по 2 флакона или ампулы
от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. При
количестве в серии флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3
флакона или ампулы от каждой серии. Для проведения испытания из
отобранных флаконов или ампул готовят общий раствор (смешанная
проба). Общее количество отобранного лекарственного средства
должно быть достаточным для проведения трех полных испытаний.
ИСПЫТАНИЕ НА ПИРОГЕННОСТЬ
Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола, не
альбиносах, массой 2-3, 5 кг, содержавшихся на полноценном
рационе. Каждый кролик должен находиться в отдельной клетке в
помещении с постоянной температурой. Колебания температуры не
могут превышать +/-3 град. С. При уборке клеток и взвешивании
животных их оберегают от возбуждения (избегать шума и резких
движений).
В течение недели, предшествующей опыту, кролики не должны
терять в массе. Взвешивание их проводят до дачи корма не менее 3
раз через день. Животные, теряющие в массе, к опыту непригодны. В
течение 3 сут перед испытанием у каждого подопытного кролика
измеряют температуру. Измерения проводят ежедневно утром до дачи
корма при помощи медицинского ртутного или электротермометра,
позволяющего определить температуру с точностью до 0,1 град. С.
Датчик термометра вводят в прямую кишку на глубину 7-9 см (в
зависимости от массы кролика) за внутренний сфинктер на время,
необходимое для достижения максимальной температуры. Исходная
температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5-39,5
град. С. Животные с более высокой или более низкой температурой
для опыта непригодны. Кроме того, кроликов, впервые
предназначаемых для испытания лекарственных средств, проверяют на
реактивность путем внутривенного введения 10 мл/кг 0,9%
стерильного непирогенного раствора натрия хлорида,
соответствующего требованиям фармакопейной статьи. В случае
изменения температуры у кроликов более чем на +/-0,4 град. С
животные считаются непригодными для опыта.
Не позднее чем за 18 ч до опыта кроликов переводят в
помещение, в котором осуществляют испытание на пирогенность. Оно
должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой,
не отличающейся от температуры помещения, в котором кролики
постоянно содержались до опыта, более чем на +/-2 град. С, и с
колебаниями во время испытания, не превышающими 2 град. С,
изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером накануне
опыта у животных отбирают остаток корма. До и во время опыта
животные корма не получают (воду дают без ограничения).
Если нет других указаний в частной статье, для испытания
отбирают не менее 2 флаконов или ампул от каждой серии, содержащей
от 1000 до 10000 флаконов или ампул. При количестве в серии
флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3 флакона или ампулы от
каждой серии. Из отобранных флаконов или ампул готовят общий
раствор (смешанная проба). От серии, содержащей до 1000 флаконов
или ампул, для испытания отбирают по 1 флакону или ампуле.
Вода для инъекций или другие применяемые растворители, а также
шприцы и иглы должны быть стерильными и непирогенными. Испытуемые
лекарственные средства должны быть стерильными. Их вводят кроликам
в ушную вену. Другие пути введения указывают в частной статье на
лекарственное средство. Для каждого кролика берут отдельную иглу.
Растворы испытуемых лекарственных средств, подогретые до 37 град.
С (при отсутствии других указаний в частных статьях), вводят в
количествах и растворителях, предусмотренных соответствующими
частными статьями. Для испытания на пирогенность воды для инъекций
предварительно готовят из нее изотонический 0,9% раствор натрия
хлорида. Натрия хлорид должен быть стерильным и непирогенным, что
обеспечивается воздушным методом его стерилизации при температуре
180 или 200 град. С в течение от 30 до 60 мин в зависимости от
массы образца. Шприцы, иглы и необходимую стеклянную посуду
стерилизуют этим же методом при температуре 180 град. С в течение
60 мин. Количество вводимого изотонического 0,9% раствора натрия
хлорида составляет 10 мл на 1 кг массы кролика. Все количество
раствора, предварительно нагретого до 37 град. С, вводят в течение
2 мин.
Испытуемый раствор проверяют на 3 кроликах. Группа должна
состоять из животных, близких по массе (отличающихся не более чем
на 0,5 кг). Перед введением раствора у кролика дважды с интервалом
30 мин измеряют температуру. Различия в показателях температуры не
должны превышать 0,2 град. С. В противном случае кролик для
испытания не используется. Результат последнего измерения
принимают за исходную температуру. Раствор вводят не позднее чем
через 15-30 мин после последнего измерения температуры.
Последующее измерение температуры при внутривенном введении
испытуемого раствора проводят 3 раза с промежутками в один час.
При других путях введения - 5 раз с промежутками в один час, если
в частной статье нет других указаний.
Воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают
непирогенными, если сумма повышений температуры у 3 кроликов
меньше или равна 1,4 град. С. Если эта сумма превышает 2,2 град.
С, то воду для инъекций или раствор лекарственного средства
считают пирогенными. В случаях, когда сумма повышений температуры
у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2 град. С, испытание
повторяют дополнительно на 5 кроликах. В этом случае воду для
инъекций или раствор лекарственного средства считают
непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов
не превышает 3,7 град. С. Если же эта сумма равна 3,8 град. С или
больше, воду для инъекций или раствор лекарственного средства
считают пирогенными.
В частной фармакопейной статье могут быть указаны другие
пределы отклонения температуры.
Если в частной статье на лекарственное средство нет других
указаний, случаи понижения температуры у кроликов принимают за
нуль.
Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для
определения пирогенности повторно, но не ранее чем через 3 сут,
если введенный им до этого раствор лекарственного средства или
вода для инъекций были непирогенными. Если же введенный раствор
лекарственного средства или вода для инъекций оказались
пирогенными, кролики могут быть использованы для дальнейших опытов
через 2 нед. При повышении температуры у кроликов в подобных
случаях на 1,2 град. С и более они используются через 3 нед. Если
исследуемые вещества обладают антигенными свойствами, то одних и
тех же кроликов нельзя использовать для испытания повторно (если
нет специальных указаний в частной статье).
Примечания. На основании опыта контроля на пирогенность
медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) допускаются
следующие особенности при испытании этих препаратов.
1. Испытание МИБП проводят на кроликах массой 1,5-2,5 кг.
2. Проверка реактивности кроликов является необязательной.
3. Термометр вводят в прямую кишку на глубину 5-7 см (в
зависимости от массы кролика).
4. Понижение температуры учитывают так же, как ее повышение.
5. Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для
определения пирогенности повторно (но не более 3 раз) с интервалом
2-3 сут, если ранее введенный препарат был непирогенным. Если
введенный препарат оказался пирогенным, кролики не могут быть
использованы повторно.
ИСПЫТАНИЕ НА СОДЕРЖАНИЕ ВЕЩЕСТВ
ГИСТАМИНОПОДОБНОГО ДЕЙСТВИЯ
Настоящая фармакопейная статья является общей и касается
метода испытания на содержание веществ гистаминоподобного действия
лекарственных средств, предназначенных для парентерального
применения.
Испытание проводят на кошках обоего пола массой не менее 2 кг
под уретановым наркозом. Уретан вводят внутрибрюшинно из расчета
1-1,2 г на 1 кг массы животного в 3-5 мл дистиллированной воды. В
случае недостаточной глубины наркоза вводят дополнительно
внутривенно уретан в количестве 1 г в 3 мл воды на животное или
этаминал - натрий в виде 2% раствора в количестве 0,2 мл/кг
внутривенно. Скорость введения указанных растворов 0,1 мл в
секунду.
Допускается также применение в качестве наркотического
средства гексенала в дозе 350-400 мг/кг в 2-3 мл воды под кожу или
внутримышечно.
Для регистрации артериального давления в отпрепарированную
сонную артерию вставляют канюлю, заполненную раствором,
предупреждающим свертывание крови (насыщенный раствор натрия
гидрокарбоната, 25% раствор магния сульфата, раствор гепарина,
содержащий 50 ЕД в 1 мл, и др.), и соединяют ее с ртутным
манометром. Запись давления производят на ленте кимографа.
Испытуемые растворы вводят внутривенно.
Вначале проверяют чувствительность животного к гистамину.
Для приготовления основного раствора гистамина, содержащего 1
мг гистамина - основания в 1 мл воды, около 138,1 мг (точная
навеска) гистамина фосфата или около 82,8 мг (точная навеска)
гистамина дигидрохлорида растворяют в 50 мл дистиллированной воды.
Раствор хранят не более 1 мес в склянке из темного стекла с
притертой пробкой в защищенном от света месте при температуре от 4
до 10 град. С.
В качестве основного раствора гистамина можно использовать
также 0,1% раствор гистамина дигидрохлорида в ампулах, в 1 мл
которого содержится 0,6038 мг гистамина - основания.
Из основного раствора гистамина непосредственно перед опытом
путем последовательных разведений в воде или в растворе натрия
хлорида изотонического 0,9% для инъекций в зависимости от
растворителя для испытуемого препарата, указанного в
соответствующей статье, готовят стандартные растворы, содержащие
0,5 и 1 мкг/мл гистамина - основания.
Для проверки реакции животного на гистамин в вену
последовательно вводят указанные стандартные растворы с
промежутками не менее 5 мин в дозах 0,1 и 0,2 мкг
гистамина - основания в 0,2 мл на 1 кг массы. Скорость введения
раствора 0,1 мл в секунду. Животных, у которых при введении
гистамина в дозе 0,2 мкг на 1 кг массы артериальное давление
снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из опыта исключают.
После проверки чувствительности животного к гистамину уточняют
величину гипотензивной реакции посредством повторного введения
стандартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг (0,2 мл раствора)
на 1 кг массы со скоростью 0,1 мл в секунду. Введение гистамина с
интервалом 5 мин повторяют несколько раз, пока при двух
последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение
артериального давления, которое принимается за стандартное в
данных условиях опыта.
Затем с интервалом не менее 5 мин животному вводят испытуемый
раствор лекарственного средства с той же скоростью, с которой
вводили раствор гистамина.
Растворитель и концентрация испытуемого раствора (тест - доза)
указаны в соответствующей фармакопейной статье. Препарат считают
выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после
введения тест - дозы не превышает реакции на введение 0,1 мкг/кг
гистамина в стандартном растворе.
При испытании в одном опыте разных лекарственных средств
необходимо проводить дополнительное определение реакции животного
на введение стандартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг/кг.
Отмеченная при этом величина реакции принимается как стандартная
для последующего испытания препарата.
В случае значительного уменьшения величины реакции по
сравнению с наблюдаемой в начале опыта необходимо вновь проверить
чувствительность животного к действию гистамина в дозе 0,2 мкг/кг.
Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм
рт. ст., испытание препаратов продолжают в соответствии с
указанными выше требованиями,
Для испытания на содержание веществ гистаминоподобного
действия отбирают по 2 флакона или ампулы от каждой серии,
содержащей не более 10000 флаконов или ампул. При количестве в
серии флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3 флакона или
ампулы от каждой серии. Из отобранных флаконов или ампул готовят
общий раствор (смешанная проба) для испытаний.
МЕТОДЫМИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ
Лекарственные средства для инъекций, глазные капли, мази,
пленки, другие лекарственные средства, в отношении которых имеются
соответствующие указания в нормативно - технической документации
(НТД), должны быть стерильными. Стерильность лекарственных средств
достигается соблюдением необходимых санитарно - гигиенических
условий их изготовления и режима стерилизации.
Методы контроля стерильности, изложенные в данной статье,
применяют для испытания всех лекарственных средств независимо от
их природы и лекарственной формы, если нет других указаний в
частных фармакопейных статьях.
Отбор образцов для анализа. Образцы готовых лекарственных
средств отбирают для контроля от каждой серии в количествах,
зависящих от вида стерилизации и числа единиц (ампул, флаконов и
т.д.) в серии.
В случае, если лекарственное средство стерилизуют насыщенным
паром при избыточном давлении 0,11 +/- 0,02 МПа (1,1 +/- 0,2
кгс/кв. см) и температуре (121 +/- 1) град. С, образец состоит из
10 единиц. При других видах стерилизации минимальное количество
---
образцов для анализа определяют по формуле n = 0,4 \/ N, где n -
число единиц в образце, а N - число единиц в исследуемой серии
препарата, при этом n должно быть не менее 3 и не более 40.
Определение антимикробного действия лекарственного средства.
Во избежание неправильной оценки результатов анализа необходимо
определить однократно для каждого наименования лекарственного
средства, обладает ли оно антимикробным действием. Для этого в две
пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и в две - с 10 мл среды
Сабуро добавляют соответствующее количество исследуемого
лекарственного средства (табл. 12) и вносят в каждую пробирку по
0,1 мл микробной взвеси соответствующего тест - штамма, содержащей
1000 клеток в 1 мл. Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при
температуре от 30 до 35 град. С в течение 48 ч, а на среде Сабуро
- при температуре от 20 до 25 град. С в течение 72 ч.
Контролем служат пробирки с питательными средами, в которые
вместо данного лекарственного средства вносят аналогичное
количество дистиллированной воды или соответствующего
растворителя.
Для проверки антибактериального действия лекарственных средств
используют тест - микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538
Р, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, а
противогрибкового действия - Candida albicans ATCC 885-653 (см.
табл. 13).
При отсутствии антимикробного действия лекарственного средства
в контрольных и опытных пробирках (колбах) должен наблюдаться рост
перечисленных тест - микроорганизмов.
При наличии антимикробного действия лекарственных средств
используют соответствующие инактиваторы, указанные в частных
фармакопейных статьях: (напр.: пара - аминобензойная кислота для
сульфаниламидов, пенициллиназа - для пенициллинов и цефалоспоринов
и т.д.). При отсутствии инактиватора препарат разводят, изменяя
соотношение объемов посевного материала и питательной среды.
Первоначально, не изменяя количества посевного материала,
указанного в табл. 12, увеличивают объем питательной среды до 250
мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие
лекарственного средства, уменьшают объем посевного материала до 1
мл.
В случае неэффективности разведения лекарственного средства
используют метод мембранной фильтрации.
Посев лекарственных средств. Для контроля стерильности
лекарственных средств применяют тиогликолевую среду и жидкую среду
Сабуро. При этом используют метод прямого посева на питательные
среды или метод мембранной фильтрации.
Метод прямого посева. Испытуемый препарат, если необходимо,
растворяют в соответствующем растворителе и высевают в
количествах, указанных в табл. 12.
При испытании лекарственных средств посевы в тиогликолевой
среде инкубируют при температуре от 30 до 35 град. С, а в среде
Сабуро - от 20 до 25 град. С. Продолжительность инкубации посевов
в обеих питательных средах составляет 14 сут.
Таблица 12
Количество испытуемого препарата для посева
в зависимости от объема содержимого единиц
(ампул, флаконов и др.), составляющих серию
------------------T--------------T-------------------------------
¦Объем содержимого¦ Объем ¦ Объем питательной среды ¦
¦одной единицы, мл¦лекарственного¦ ¦
¦ ¦ средства для ¦ ¦
¦ ¦ посева, мл ¦ ¦
+-----------------+--------------+-------------------------------+
¦Менее 1 ¦Весь объем ¦В 10 раз больше объема образца ¦
¦1 - 4 ¦1 ¦для посева ¦
¦5 - 19 ¦2 ¦ ¦
¦20 - 100 ¦2 - 4 ¦ ¦
¦Более 100 <*> ¦10 ¦ ¦
L-----------------+--------------+--------------------------------
--------------------------------
<*> Если объем содержимого единицы превышает 100 мл,
предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации.
В случае помутнения питательной среды после внесения в нее
испытуемого препарата следует в интервале от 3 до 7 сут. после
посева сделать пересев на свежие аналогичные среды и инкубировать
их при соответствующей температуре 14 сут от начала испытания.
При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах
отбирают асептически по 0,1 г (мл) от каждой единицы и вносят в
стерильную колбу вместимостью 250 мл, содержащую стеклянные бусы,
100 мл 1/15 мол фосфатного буферного раствора (рН 6,8-7,0) и
эмульгатор. Перед проведением испытания содержимое колбы
подогревают до температуры (41 +/-1) град. С. Колбу с испытуемым
образцом встряхивают не более 30 мин до получения однородной
эмульсии. Полученную эмульсию в количестве 5 мл переносят в колбу
с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл - в колбу с 40 мл среды Сабуро.
Посевы инкубируют 14 сут при соответствующей температуре для
каждой питательной среды.
Примечания. 1. Выбор эмульгатора и его количество зависят от
природы мази и растворов лекарственных средств в маслах. Наиболее
часто применяют твин-80 в концентрации до 2,5%, не оказывающей
антимикробного действия.
2. При испытании мазей, легко эмульгируемых в воде, эмульгатор
не вносят в буферный раствор.
3. При испытании мазей и растворов в маслах предпочтительнее
использовать метод мембранной фильтрации.
Метод мембранной фильтрации. При определении стерильности
лекарственных средств, обладающих выраженным антимикробным
действием, и лекарственных средств, разлитых в емкости более 100
мл, используют метод мембранной фильтрации.
При испытании лекарственных средств с антимикробным действием
от каждой серии независимо от ее объема отбирают 30 емкостей
(ампул, флаконов и др.), которые делят на 3 группы по 10 емкостей.
Емкости двух групп (20 штук) используют для испытания на
стерильность, третьей группы (10 штук) - для контроля полноты
отмывания мембраны от лекарственного средства.
Испытание лекарственного средства на стерильность проводят с
использованием фильтрационной установки, включающей
фильтродержатель, соединенный с колбой - приемником.
Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из
пористой пластины, на которую помещают мембрану. Используют
мембраны с размером пор 0,45 +/-0,02 мкм, диаметром около 47 мм.
Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт. ст.) при
скорости вытекания воды 55-75 мл в 1 мин. Допускается
использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую
систему и работающего также по принципу фильтрации растворов.
Для фильтрации водных, масляных и спиртовых растворов
рекомендуют использовать фильтры из эфиров целлюлозы или смесей
эфиров целлюлозы. Фильтровальную установку в собранном виде
стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11 +/- 0,02
МПа [(1,1 +/- 0,2) кгс/кв. см] и температуре (121 +/-1) град. С в
течение 20 мин (температура и время критические). Стерилизацию
можно осуществлять любым другим способом, обеспечивающим
сохранность рабочих характеристик мембраны, а также стерильность
мембраны и всей установки (ионизирующее излучение, окись этилена и
т.п.).
Испытуемое лекарственное средство растворяют или суспендируют
(если в этом есть необходимость) в соответствующей стерильной
жидкости и полученный раствор или суспензию пропускают через
стерильную мембрану. Для растворения лекарственных средств с
антимикробным действием и отмывания мембраны от них можно
использовать любой растворитель, не подавляющий роста
микроорганизмов, например, раствор натрия хлорида изотонического
0,9% для инъекций. Используемый растворитель перед стерилизацией
необходимо профильтровать через мембраны с порами размером 0,45
+/-0,02 мкм для освобождения от механических примесей.
Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических
условиях. Испытуемый раствор пропускают с помощью вакуума через
одну или несколько мембран. При испытании лекарственных средств с
антимикробным действием или содержащих консервант после окончания
фильтрации мембрану необходимо промыть 3-5 порциями по 100 мл
соответствующего растворителя, например растворам натрия хлорида
изотонического 0,9% для инъекций или жидкости N 1 (см. с. 193),
при испытании мазей - жидкости N 2 (см. с. 193). После отмывания
мембраны ее извлекают, разрезают стерильными ножницами пополам и
одну половину помещают в колбу со 100 мл тиогликолевой среды,
вторую - в колбу со 100 мл среды Сабуро. Питательные среды с
помещенными в них фильтрами выдерживают при температуре от 30 до
35 град. С (тиогликолевая среда) и от 20 до 25 град. С (среда
Сабуро) в течение 7 суток при ежедневном просмотре.
Для контроля стерильности растворов лекарственных средств,
выпускаемых в виде порошков, лиофилизированных препаратов и пр.,
содержимое каждой емкости предварительно растворяют в стерильном
растворителе. Затем из каждых 10 емкостей одной группы отбирают
полученный раствор в количестве, соответствующем 200 мг
лекарственного средства, и переносят в колбу, содержащую 100 мл
аналогичного растворителя. Приготовленный раствор немедленно
фильтруют. После отмывания фильтра, как указано выше, одну
половину его помещают в колбу с тиогликолевой средой, вторую - в
колбу со средой Сабуро.
При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах
от каждой из 10 емкостей отбирают по 100 мг препарата в колбу со
100 мл растворителя (изопропилмиристат и др.), который
предварительно подогревают до температуры не выше 45 град. С и
стерилизуют фильтрованием через мембраны с размером пор
(0,22 +/- 0,02) мкм. После фильтрации образца мембрану промывают
двумя - тремя порциями по 200 мл жидкости N 2 и затем одной -
двумя порциями жидкости N 1. Половину мембраны помещают в
тиогликолевую среду, другую - в среду Сабуро, в которые
предварительно вносят стерильный твин-80 из расчета 1 г на 1000 мл
среды.
При испытании лекарственных средств, разлитых в емкости
большого объема, через фильтры пропускают содержимое 5-10
емкостей, если объем каждой емкости составляет от 100 до 500 мл.
При наличии в емкости более 500 мл раствора на стерильность
испытывают по 500 мл содержимого каждой из 5- 10 емкостей на 2-3
мембранах.
При испытании лекарственных средств, представляющих собой
вязкую жидкость или медленно фильтрующиеся суспензии, необходимо
предварительно добавить растворитель, указанный в частной статье,
для увеличения скорости фильтрации.
Контроль полноты отмывания фильтра (третья группа емкостей)
проводят следующим образом: при испытании антибактериального
лекарственного средства в колбу с тиогликолевой средой и
погруженной в нее половиной фильтра вносят суточную культуру
Staphylococcus aureus ATCC 6538 Р, при испытании противогрибкового
лекарственного средства - в колбу со средой Сабуро и фильтром
вносят 48-часовую культуру Candida albicans ATCC 885-653 из
расчета 100 микробных клеток на весь объем среды. Инкубацию
проводят при соответствующих температурах. Наличие роста
тест - микроорганизмов в контрольных колбах через 48-72 ч
свидетельствует о достаточной полноте отмывания мембран от
антимикробного лекарственного средства.
Для контроля стерильности условий, в которых проводят
испытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого
лекарственного средства с последующим воспроизведением всех
вышеописанных операций.
Учет и интерпретация результатов испытания на стерильность.
Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании
периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных
средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и
других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов
необходимо подтвердить микроскопированием мазков, окрашенных по
Граму.
Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям
испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов.
При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе)
его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком
же количестве образцов, как и в первый раз. При отсутствии роста
микроорганизмов при повторном посеве испытуемый препарат считают
удовлетворяющим требованию испытания на стерильность. В случае
роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных
с микроорганизмами, выявленными в первичном посеве, испытуемый
препарат считают нестерильным. Если при повторном посеве
наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от
первоначально выделенных, испытание повторяют в третий раз на
удвоенном количестве образцов. При отсутствии роста
микроорганизмов после инкубации посевов в третьем испытании
испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям на
стерильность. При наличии роста хотя бы в одной пробирке
испытуемый препарат считают нестерильным.
Питательные среды
Для контроля стерильности применяют "Сухую питательную среду
для контроля стерильности" (тиогликолевую) отечественного
производства (ТУ 42.14 N 161-79) и среду Сабуро (жидкую). Вместо
коммерческой тиогликолевой среды может быть использована
тиогликолевая среда индивидуального приготовления.
Состав и приготовление питательных сред. Тиогликолевая среда
индивидуального приготовления:
панкреатического гидролизата казеина 15,0 г
дрожжевого экстракта (10%) 5,0 >>
натрия хлорида 2,5 >>
глюкозы 5,0 >>
цистина (цистеина) 0,75 >>
тиогликолевой кислоты или 0,3 мл
тиогликолята натрия 0,5 г
раствора резазурина натрия 1:1000
(свежеприготовленного) <*> 1,0 мл
агара 0,75 г
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 7,0 +/- 0,2
--------------------------------
<*> Допускается приготовление среды без резазурина натрия.
Тиогликолевую среду можно хранить в течение 14 сут со дня
приготовления при температуре от 10 до 25 град. С в защищенном от
света месте.
В случае, если при хранении среды, содержащей резазурин,
верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится в розовый цвет,
среду можно регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в
течение 10-15 мин до исчезновения розовой окраски с последующим
быстрым охлаждением. В случае, если окраска не исчезает после
нагревания, среду считают непригодной к употреблению. Регенерацию
среды можно проводить только один раз.
Среда Сабуро:
пептона ферментативного 10 г
глюкозы 40 >>
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 5,6 +/- 0,2
Обе среды стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении
0,11 +/-0,02 МПа (1,1 +/-0,2 кгс/кв. см) и при температуре (121
+/-1) град. С в течение 15 мин.
Жидкость N 1:
пептона ферментативного 1 г
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 7,1 +/-0,2
Жидкость N 2:
пептона ферментативного 5 г
твина-80 10 г
воды дистиллированной до 1000 мл
рН после стерилизации 7,1 +/-0,2
Жидкости разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют так же, как
и питательные среды.
Требования к ростовым свойствам питательных сред.
Тиогликолевая среда и среда Сабуро должны обеспечивать визуально
обнаруживаемый рост соответствующих тест - штаммов аэробных и
анаэробных бактерий и грибов (предусмотренных НТД).
Используемые питательные среды должны обеспечивать рост
микроорганизмов при посеве их в количестве менее 100
жизнеспособных клеток: для тиогликолевой среды - не позднее 48 ч
инкубации при температуре от 30 до 35 град. С и для среды Сабуро -
не позднее 72 ч инкубации при температуре от 20 до 25 град. С.
ИСПЫТАНИЕ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЧИСТОТУ
Лекарственные средства (таблетки, капсулы, гранулы, растворы,
экстракты, сиропы, мази и др.), не стерилизуемые в процессе
производства, могут быть контаминированы микроорганизмами и
поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту.
Таблица 13
Тест - микроорганизмы, используемые для
определения антимикробного действия лекарственных
средств и ростовых свойств питательных сред
------------------T---------------------------------T------------
¦ N по Каталогу ¦ ¦ ¦
¦ штаммов ¦ ¦Питательная ¦
¦ Всесоюзного ¦ Тест - штаммы ¦ среда ¦
¦музея патогенных ¦ ¦ N ¦
¦бактерий ГИСК им.¦ ¦ ¦
¦ Л.А.Тарасевича ¦ ¦ ¦
+-----------------+---------------------------------+------------+
¦ 010011 ¦Bacillus subtilis ATCC 6633 ¦ 1 ¦
¦ 010014 ¦Bacillus cereus ATCC 10702 ¦ 1 ¦
¦ 240533 ¦Escherichia coli ATCC 25922 ¦ 3 ¦
¦ ¦ ¦ 6 ¦
¦ ¦ ¦ 7 ¦
¦ 190155 ¦Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ¦ 9 ¦
¦ 201108 ¦Staphylococcus aureus ATCC 6538-P¦ 10 ¦
¦ ¦ ¦ 8 ¦
+-----------------+---------------------------------+------------+
¦N в коллекции ¦ ¦ ¦
¦патогенных ¦ ¦ ¦
¦грибов НИО ¦ ¦ ¦
¦глубоких микозов ¦ ¦ ¦
¦Ленинградского ¦ ¦ ¦
¦ГИДУВ ¦ ¦ ¦
+-----------------+---------------------------------+------------+
¦ 259 ¦Candida albicans ATCC 885-653 ¦ 2 ¦
L-----------------+---------------------------------+-------------
Испытание на микробиологическую чистоту включает
количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов, а
также выявление определенных видов микроорганизмов, наличие
которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.
Испытание проводят в асептических условиях, применяя
приведенные методы и питательные среды для контроля всех видов
нестерильных лекарственных средств, а также сырья, используемого в
их производстве.
Лекарственные средства, обладающие антимикробным действием, и
консерванты, входящие в состав некоторых нестерильных
лекарственных средств, могут подавлять рост отдельных видов
микроорганизмов в условиях проведения испытания.
Во избежание неправильной оценки результатов испытания
определяют действие лекарственного средства в отношении следующих
тест - микроорганизмов: Bacillus subtilis (Bacillus cereus),
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,
Candida albicans, указанных в табл. 13.
Определение антимикробного действия лекарственного средства.
Пять образцов лекарственного средства по 1 г (мл) каждый разводят
в соотношении 1:10 фосфатным буферным раствором рН 7,0 (два
образца), средой N 3 (один образец) и средой N 8 (два образца).
Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus выращивают на
жидкой среде N 1 при температуре от 30 до 35 град. С в течение
18-20 ч, культуру Candida albicans - на жидкой среде N 2 при
температуре от 20 до 25 град. С в течение 48 ч. Культуры разводят
1:1000 стерильным 0,9% раствором натрия хлорида изотоническим,
вносят по 1 мл взвеси каждого тест - штамма (в отдельности) в
приготовленные образцы лекарственного средства в буферном растворе
(Bacillus subtilis, Candida albicans), в среде N 3 (Escherichia
coli) и в среде N 8 (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus). Для выявления микроорганизмов используют методы,
приведенные в данной статье. В случае отсутствия роста тест -
штаммов на соответствующих питательных средах отмечают
антимикробное действие лекарственного средства.
Для устранения антимикробного действия лекарственного средства
используют различные методы: 1) увеличивают разведение
лекарственного средства, взяв больший объем растворителя; 2)
добавляют необходимое количество соответствующего специфического
инактиватора, нейтрализующего антимикробное действие
лекарственного средства, но не угнетающего рост микроорганизмов
(например, пенициллиназу - для пенициллинов и цефалоспоринов,
пара - аминобензойную кислоту - для сульфаниламидов); 3)
комбинируют методы 1 и 2; 4) вводят неспецифические инактиваторы в
питательные среды, нейтрализующие антимикробное действие
лекарственного средства (например, 4% твина-80, 0,5% <