Степень загрязненности водоемов оценивают на основе количественного учета сапрофитной микрофлоры и специфических показателей фекального загрязнения. По эпидемическим показаниям определяют содержание в воде соответствующих патогенных микроорганизмов.
Поступающие в воду органические вещества служат пищей микроорганизмам, и поэтому обогащение воды этими веществами непременно влечет за собой вспышку развития микрофлоры. Уве.тичение количества бактерий-сапрофитов при загрязнении водоемов наблюдается прежде, чем становится заметным изменение химических показателей воды. По этой причине учет сапрофитной микрофлоры—очень важный показатель санитарного состояния водоема. Чем больше загрязнен водоем, тем относительно больше в нем бактерий-сапрофитов. Сапрофитные бактерии обычно учитываются методом посева анализируемого материала соответствующего разведения на мясо-пептонный агар—МПА. На этой среде, естественно, прорастают не все сапрофитные бактерии, но это наиболее универсальная питательная среда, обеспечивающим потребности большинства гетеротрофов. По этой причине МПА принят в качестве стандартной среды для учета сапрофитных бактерий. Количество колоний, вырастающих на МПА в чашках Петри после 48 ч, инкубации при температуре 20 °С из 1 мл жидкости или 1 г твердых субстратов, называется микробным числом Допустимо определять микробное число путем инкубации чашек Петри с МПА в термостате в течение 24 ч при температуре 37 °С
По данным Б. В. Перфильева и А. С. Разумова, в очень чистых водоемах отношение бактерий, регистрируемых прямым счетом, к числу бактерий, вырастающих на мясо-пептонном агаре, достигает 1000:1. По мере загрязнения воды это отношение уменьшается, и в сточной воде оно часто составляет 1:1. Прямой счет бактерий не входит в стандартные методы анализа питьевой и при родной воды, но сопоставление результатов учета количества бактерий методом прямого счета и методом посева может дать представление о степени загрязненности водоема органическими веществами.
Фекальное загрязнение воды устанавливается по содержанию в воде водоема кишечной палочки Escherichia coli. Кишечная палочка наряду с энтерококками и Clostridium perfringens—постоянный нормальный обитатель кишечника человека, домашних животных, а также диких животных, распространенных в местностях, населенных людьми. По срокам выживания во внешней среде она ближе других бактерий стоит к возбудителям кишечных инфекций, так как энтерококк менее, a Cl. perfringens более устойчивы, чем патогенные бактерии семейства Enterobacteriaceae Присутствие в воде кишечной палочки свидетельствует о фекальном загрязнении и о потенциальной возможности содержания в воде возбудителей кишечных инфекций. Отсутствие кишечной палочки гарантирует отсутствие в воде представителей семейства Enterobacteriaceae.
Количество кишечных палочек в воде выражается при помощи коли-титра и коли-индекса. Коли-титр—это наименьший объем воды в миллилитрах, содержащий одну клетку кишечной палочки Коли-индекс—количество кишечных палочек в 1 л воды. Произведение коли-титра на коли-индекс всегда равно 1000. Например в 1 л воды содержится 10 клеток Е. coli. Это означает, что коли-индекс равен 10 и что одна клетка содержится в 100 мл воды, т. е. коли-титр = 100. 100х10=1000.
По ныне действующему стандарту (ГОСТ 2874—73 «Вода питьевая») коли-титр должен быть не менее 333 и соответственно коли-индекс—не более 3.
Бактерии группы кишечной палочки весьма разнообразны по своим физиологическим свойствам. Сюда относится собственно кишечная палочка—Е. coli commune и близкие к ней E. coli citrovorum, E. coli aerogenes, а также Е. paracoli. Эти бактерии отличаются друг от друга по способности к газообразованию, продуцированию индола, использованию цитрата и по некоторым другим биохимическим признакам. Все они попадают в воду в результате фекального загрязнения, но Е. coli commune свидетельствует о свежем загрязнении, а Е. coli aerogenes—о старом. Во многих странах Западной Европы показателем фекального загрязнения считается только Е. coli commune, и потому в стандартных методах анализа воды используются специальные тесты для диагностики кишечной палочки. В СССР согласно ГОСТ 2874-73 показателем фекального загрязнения считается вся группа кишечной палочки, и поэтому тесты, отличающие Е. coli commune от других типов кишечной палочки, стандартными методами анализа не предусмотрены. Только в случае устойчивого понижения коли-титра в водопроводной воде ГОСТом предписывается проведение оксидазного теста, позволяющего отличить свежее фекальное загрязнение от старого.
В настоящее время существуют два равноценных метода анализа кишечной палочки в воде: метод мембранных фильтров и метод бродильных проб.
Мембранные фильтры представляют собой пористую пластинку с диаметром пор 0,35—1,20 мкм. В зависимости от диаметра пор различают шесть номеров фильтра. Чем выше номер, тем крупнее поры. Для анализа кишечной палочки применяют фильтры № 2 и № 3 с диаметром пор 0,50—0.70 мкм. Перед употреблением мембранные фильтры кипятят в течение 30 мин в свежеперегнанной дистиллированной воде.
Анализ воды методом мембранных фильтров включает два этапа и занимает двое суток. На первом этапе определенный объем исследуемой воды фильтруется при отрицательном давлении через мембранный фильтр с задержанными на нем бактериями помещают в чашку Петри на фуксинсульфитную среду и выдерживают в термостате при температуре 37?С 24 ч. Кишечная палочка в этих условиях прорастает в виде колоний, окрашенных в красный цвет в различной степени. Для фишечной палочки наиболее характерны темно-красные колонии с металлическим блеском, но возможны и розовые колонии с темным центром, и прозрачные неокрашенные колонии. Появление на фильтре колоний свидетельствует о возможности фекального загрязнения. Из двух-трех колоний, выросших на фильтре, как окрашенных, так и бесцветных, готовят препараты с окраской по Граму. Отсутствие в мазках грамотрицательных неспороносных палочек дает окончательный ответ об отсутствии фекального загрязнения. В этом случае анализ заканчивается на первом этапе.
В противном случае, т. е. при обнаружении в мазках неспороносных грамотрицательных палочек, переходят ко второму этапу анализа. Он заключается в посеве содержимого колоний, из которых готовились мазки, в пробирки на жидкую глюкозо-пептонную среду. Посевы помещают в термостат с температурой 37 °С на 24 ч. Образование на этой среде газа достоверно свидетельствует о присутствии кишечной палочки. Отсутствие газообразования дает окончательный ответ об отсутствии кишечной палочки.
Анализ воды методом бродильных проб также состоит из двух этапов. По этому методу на первом этапе происходит накопление посевного материала, для чего в сосуды с жидкой глюкозо-пептонной средой вносят различные объемы исследуемой воды. Через Т—12 ч инкубации в термостате при температуре 37 °С приступают ко второму этапу анализа. На втором этапе из всех сосудов независимо от признаков роста берут пробы для посева в две пробирки, содержащие дифференциальный агар с розоловой кислотой (РДА). В одной пробирке агар находится в виде столбика, в другой—в виде скошенного агара. Посев делают петлей с широким ушком сначала уколом в столбик, а затем на поверхность косого агара. После отсева сосуды с глюкозо-пептонной средой продолжают инкубировать при температуре 37 °С в течение еще 24 ч роста. В случае необходимости, но не позднее этого срока, посев повторяют. Пробирки с РДА ставят,на выращивание при температуре 37 °С на 12 ч. Через 24 ч после посева воды и через 12 ч после пересева на РДА просматривают РДА и отмечают результаты роста: изменение цвета среды, газообразование, характер роста на косом агаре. Признаки присутствия кишечной палочки следующие: на глюкозо-пептонной среде наблюдается помутнение и газообразование или только помутнение. Столбик РДА окрашивается в желтый цвет с разрывами, конденсационная жидкость вспенивается. На косом РДА развиваются отдельные желтые колонии или наблюдается сплошной рост в виде желтого штриха. Для окончательной идентификации кишечной палочки приготовляют мазки и окрашивают их по Граму.
При исследовании природных и нехлорированных очищенных вод результат считается отрицательным, если в глюкозо-пептонной среде наблюдается помутнение или помутнение с газообразованием, а РДА не изменяет цвета. В результате хлорирования кишечная палочка изменяет свои свойства. На РДА она образует не желтые, а серые колонии без окрашивания агара и без газообразования. Кишечную палочку обнаруживают путем микроскопирования и окраски по Граму содержимого колоний или штриха с РДА.
Рисунок
При анализе кишечной палочки методом бродильных проб коли-титр и коли-индекс устанавливают на основании статистических таблиц.
Результаты бактериологического анализа весьма показательны при оценке степени загрязненности водоема. Особенно важны данные о титре кишечной палочки, так как они дают основание судить о возможности присутствия в воде патогенных микроорганизмов (табл. 4).
Достоверный вывод о степени загрязненности водоема может быть сделан только на основе комплексного исследования воды с помощью бактериологических и физико-химических анализов.