Требования, предъявляемые к ним.

Важным моментом при конструировании ДНК-вакцин является проблема целенаправленной доставки генов в необходимые клетки и защиты вводимых ДНК от действия нуклеаз крови. В результате экспериментальной работы были созданы разнообразные конструкции, позволяющие доставлять целевые гены в клетки-мишени. Одной из подобных конструкций является модель молекулярного вектора для доставки генов в такие клетки, как лимфоциты и кераноциты. В качестве модельного был использован ген, кодирующий гибридный белок: фактор некроза опухолей-альфа - интерферон-гамма. В центре вектора находится интактная плазмидная ДНК, содержащая доставляемый ген, а на поверхности располагаются антитела к клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина со спермидином и антителами применяется для связи компонентов (положительно заряженный спермидин обеспечивает связывание конъюгата с плазмидной ДНК). Описанный молекулярный вектор позволяет целенаправленно доставлять гены в клетки-мишени, сводя до минимума их попадание в другие виды клеток, защищать доставляемые гены от нуклеаз крови и использовать положительно заряженный комплекс спермидин-полиглюкин в качестве стимулятора проникновения ДНК в клетки. В настоящее время также создана векторная модель для доставки в клетки костного мозга гена, кодирующего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ).

17. Создание с помощью методов генетической инженерии высокоактивных продуцентов лекарственных веществ

Воз­никно­вение и фор­ми­рова­ние ген­ной ин­же­нерии как на­уки в се­реди­не 70-х гг. XX ве­ка пос­лу­жило зна­читель­ным им­пуль­сом для раз­ви­тия би­отех­но­логи­чес­ко­го про­из­водс­тва би­оло­гичес­ки ак­тивных ве­ществ (БАВ), в том чис­ле и бел­ко­вых пре­пара­тов ме­дицин­ско­го наз­на­чения. Воз­можность конс­тру­иро­вания ор­га­низ­мов с за­дан­ны­ми свой­ства­ми су­щес­твен­но ви­до­из­ме­нила струк­ту­ру и со­дер­жа­ние сов­ре­мен­но­го би­отех­но­логи­чес­ко­го про­из­водс­тва БАВ:

1) зна­читель­но по­выси­лась про­дук­тивность про­из­водс­твен­ных штам­мов мик­ро­ор­га­низ­мов – про­дуцен­тов це­левых про­дук­тов за счет усо­вер­шенс­тво­вания ме­табо­личес­ко­го пу­ти их би­осин­те­за (вве­дение до­пол­ни­тель­ных ге­нов, уве­личе­ние их ко­личес­тва или ак­тивнос­ти и т.п.);

2) за счет вве­дения чу­жерод­ных ге­нов в мик­робную клет­ку уда­лось по­лучить про­дуцен­ты, син­те­зиру­ющие из­на­чаль­но нес­вой­ствен­ные им со­еди­нения, в том чис­ле бел­ки че­лове­ка (ин­терфе­роны, ин­терлей­ки­ны, гор­мон рос­та, ин­су­лин и др.) и фер­менты (про­те­азы, ли­пазы, про­те­ина­зы и др.), что спо­собс­тво­вало зна­читель­но­му рас­ши­рению ас­сорти­мен­та и раз­но­об­ра­зия би­отех­но­логи­чес­кой про­дук­ции.

В нас­то­ящее вре­мя с по­мощью ме­тодов ген­ной ин­же­нерии, в том чис­ле и пос­редс­твом би­отех­но­логии ре­ком­би­нан­тных ДНК (рДНК), кло­ниро­вано бо­лее 500 ге­нов раз­личных бел­ков че­лове­ка, ко­торые уже яв­ля­ют­ся или мо­гут в ско­ром вре­мени стать ЛС. По под­сче­там спе­ци­алис­тов ВОЗ, еже­год­ный объ­ем ми­рово­го рын­ка ле­карс­твен­ных пре­пара­тов (ЛП) на ос­но­ве бел­ков че­лове­ка сос­тавля­ет по­ряд­ка 200 млрд дол­ла­ров, что в це­лом со­от­ветс­тву­ет 17% об­ще­миро­вого фар­ма­цев­ти­чес­ко­го рын­ка. Сле­ду­ет от­ме­тить, что ры­нок пре­пара­тов ре­ком­би­нан­тных бел­ков не­ук­лонно раз­ви­ва­ет­ся и рас­тет, дос­ти­гая по­ряд­ка 19% в год. При этом до­ля Рос­сии в про­из­водс­тве дан­ных ЛС сос­тавля­ет все­го 0,6%. По ре­зуль­та­там эк­спертной оцен­ки к 2020 г. в на­шей стра­не пла­ниру­ет­ся вы­вес­ти на ры­нок око­ло 200 ин­но­ваци­он­ных пре­пара­тов оте­чес­твен­ной раз­ра­бот­ки, про­из­во­димых на тер­ри­тории РФ. К ним преж­де все­го от­но­сят­ся: ин­су­лин (29%), эрит­ро­по­этин (12%), гор­мон рос­та (5%), α-ин­терфе­рон (21%), β-ин­терфе­рон (11%), фак­то­ры свер­ты­вания кро­ви (6%) и др

Наг­лядным при­мером ус­пе­хов ре­али­зации тех­но­логий рДНК в би­отех­но­логии слу­жит про­из­водс­тво ин­терфе­ронов. В нас­то­ящее вре­мя мож­но по­лучить лю­бое не­об­хо­димое ко­личес­тво ин­терфе­рона для це­лей кли­ничес­кой прак­ти­ки. Так, с по­мощью ме­тодов би­отех­но­логии мож­но из 1 л куль­ту­ры тка­ни по­лучить по­ряд­ка 10⁸ ед. ин­терфе­рона, в то вре­мя как 1 л куль­ту­ры E. coli поз­во­ля­ет по­лучить 10¹⁰ ед. ре­ком­би­нан­тно­го ин­терфе­рона [2, 10].

В ка­чес­тве еще од­но­го при­мера ус­пешно­го прак­ти­чес­ко­го при­мене­ния ре­ком­би­нан­тных про­дуцен­тов сле­ду­ет от­ме­тить би­отех­но­логи­чес­кое про­из­водс­тво ин­су­лина. Так, для по­луче­ния 100 г крис­талли­чес­ко­го ин­су­лина тре­бу­ет­ся око­ло 800–1000 кг под­же­лудоч­ной же­лезы круп­но­го ро­гато­го ско­та, при этом од­на же­леза ко­ровы ве­сит по­ряд­ка 200–250 г. В этой свя­зи ин­су­лин в те­чение дол­го­го вре­мени ос­та­вал­ся очень до­рогос­то­ящим и труд­но­дос­тупным пре­пара­том для ши­роко­го кру­га боль­ных са­хар­ным ди­абе­том. Толь­ко в 1978 г. ис­сле­дова­тели ком­па­нии «Genentech, Inc.» впер­вые по­лучи­ли ин­су­лин с по­мощью спе­ци­аль­но сконс­тру­иро­ван­но­го штам­ма E. coli [2].

Кро­ме то­го, в нас­то­ящее вре­мя ряд фирм ор­га­низу­ет про­из­водс­тво ин­терфе­рона с ис­поль­зо­вани­ем ре­ком­би­нан­тных дрож­жей. К пре­иму­щес­твам дан­но­го про­дуцен­та ин­терфе­рона в срав­не­нии с E. coli от­но­сят­ся: на­личие сек­ре­тор­ных сис­тем, бла­года­ря ко­торым мож­но по­лучить внут­рикле­точ­ный ин­терфе­рон, а так­же от­сутс­твие ток­сичных ве­ществ, свой­ствен­ных бак­те­ри­аль­но­му про­дуцен­ту.

на­ибо­лее рас­простра­нен­ным про­дуцен­там бел­ко­вых пре­пара­тов от­но­сят­ся ре­ком­би­нан­тные мик­ро­ор­га­низ­мы, в том чис­ле [1, 9, 20, 21]:

E. coli;

Bacillus spp.;

Erwinia spp.;

Pseudomonas spp.;

Rhizobium spp.;

Saccharomyces cerevisiae;

Pichia pastoris и др.

При вы­боре мик­ро­ор­га­низ­ма в ка­чес­тве про­дуцен­та чу­жерод­но­го бел­ка не­об­хо­димо знать струк­ту­ру его ге­нома и ме­табо­лизм на уров­не ви­да [1, 9]. По­мимо это­го, для то­го что­бы мик­ро­ор­га­низ­мы мож­но бы­ло ис­поль­зо­вать как ге­нети­чес­ки мо­дифи­циро­ван­ные про­дуцен­ты ЛС, в том чис­ле и бел­ко­вых пре­пара­тов, они дол­жны удов­летво­рять це­лому ря­ду предъ­яв­ля­емых к ним обя­затель­ных тре­бова­ний [1, 2, 9, 22]:

1) от­сутс­твие у мик­ро­ор­га­низ­ма-ре­ципи­ен­та па­тоген­ных и ток­си­коген­ных свой­ств;

2) бе­зопас­ность ген­но-ин­же­нер­ных про­из­водных;

3) вы­сокая ско­рость раз­мно­жения штам­ма про­дуцен­та це­лево­го про­дук­та;

4) спо­соб­ность штам­мов про­дуцен­тов це­лево­го про­дук­та к рос­ту и раз­ви­тию на прос­тых, дос­тупных и эко­номич­ных пи­татель­ных сре­дах;

18. Стволовые клетки, выделение и культивирование. Область и перспективы применения

Стволовы́е кле́тки — недифференцированные (незрелые) клетки, имеющиеся у многих видов многоклеточных организмов. Стволовые клетки способны самообновляться, образуя новые стволовые клетки, делиться посредством митоза и дифференцироваться в специализированные клетки, то есть превращаться в клетки различных органов и тканей.

Стволовые клетки можно разделить на три основные группы в зависимости от источника их получения: эмбриональные, фетальные и постнатальные (стволовые клетки взрослого организма).

Эмбриональные стволовые клетки

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) образуют внутреннюю клеточную массу (ВКМ), или эмбриобласт, на ранней стадии развития эмбриона. Они являются плюрипотентными. Важный плюс ЭСК состоит в том, что они не экспрессируют HLA (human leucocyte antigens), то есть не вырабатывают антигены тканевой совместимости. Каждый человек обладает уникальным набором этих антигенов, и их несовпадение у донора и реципиента является важнейшей причиной несовместимости при трансплантации. Соответственно, шанс того, что донорские эмбриональные клетки будут отторгнуты организмом реципиента очень невысок. При пересадке иммунодефицитным животным эмбриональные стволовые клетки способны образовывать опухоли сложного (многотканевого) строения — тератомы, некоторые из них могут стать злокачественными. Достоверных данных, о том как ведут себя эти клетки в иммунокомпетентном организме, например, в организме человека, нет. Вместе с тем, следует отметить, что клинические испытания с применением дифференцированных дериватов (производных клеток) ЭСК уже начаты.

Одним из главных недостатков ЭСК является невозможность использования аутогенного, то есть собственного материала, при трансплантации, поскольку выделение ЭСК из эмбриона несовместимо с его дальнейшим развитием.

Фетальные стволовые клетки

Фетальные стволовые клетки получают из плодного материала после аборта (обычно срок гестации, то есть внутриутробного развития плода, составляет 9—12 недель). Естественно, изучение и использование такого биоматериала также порождает этические проблемы. В некоторых странах, например, на Украине и в Великобритании, продолжаются работы по их изучению и клиническому применению. К примеру, британская компания ReNeuron исследует возможности использования фетальных стволовых клеток для терапии инсульта. Эти клетки уже начали дифференцировку, и, следовательно, каждая из них, во-первых, может пройти только ограниченное число делений, и, во-вторых, дать начало не любым, а достаточно определенным видам специализированных клеток. Так, из клеток фетальной печени могут развиться специализированные клетки печени и кроветворные клетки. Из фетальной нервной ткани, соответственно, развиваются более специализированные нервные клетки.

Постнатальные стволовые клетки

Несмотря на то, что стволовые клетки зрелого организма обладают меньшей потентностью в сравнении с эмбриональными и фетальными стволовыми клетками, то есть могут порождать меньшее количество различных типов клеток, этический аспект их исследования и применения не вызывает серьёзной полемики. Кроме того, возможность использования аутогенного материала обеспечивает эффективность и безопасность лечения. Стволовые клетки взрослого организма можно подразделить на три основных группы: гемопоэтические (кроветворные), мультипотентные мезенхимальные (стромальные) и тканеспецифичные прогениторные клетки.

Иногда в отдельную группу выделяют клетки пуповинной крови, поскольку они являются наименее дифференцированными из всех клеток зрелого организма^{[источник не указан 1439 дней]}, то есть обладают наибольшей потентностью. Пуповинная кровь в основном содержит гемопоэтические стволовые клетки, а также мультипотентные мезенхимальные, но в ней присутствуют малые количества других разновидностей стволовых клеток, при определённых условиях способные дифференцироваться в клетки различных органов и тканей.

Гемопоэтические стволовые клетки

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) — мультипотентные стволовые клетки, дающие начало всем клеткам крови миелоидного (моноциты, макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты и тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидного рядов (Т-лимфоциты, В-лимфоциты и естественные киллеры). Определение гемопоэтических клеток было основательно пересмотрено в течение последних 20 лет. Гемопоэтическая ткань содержит клетки с долгосрочными и краткосрочными возможностями к регенерации, включая мультипотентные, олигопотентные и клетки-предшественники. Миелоидная ткань содержит одну ГСК на 10 000 клеток. ГСК являются неоднородной популяцией. Различают три субпопуляции ГСК, в соответствии с пропорциональным отношением лимфоидного потомства к миелоидному (Л/M). У миелоидно ориентированных ГСК низкое Л/М соотношение (>0, <3), у лимфоидно ориентированных — высокое (>10). Третья группа состоит из «сбалансированных» ГСК, для которых 3 ≤ Л/M ≤ 10. В настоящее время активно исследуются свойства различных групп ГСК, однако промежуточные результаты показывают, что только миелоидно ориентированные и «сбалансированные» ГСК способны к продолжительному самовоспроизведению. Кроме того, эксперименты по трансплантации показали, что каждая группа ГСК преимущественно воссоздаёт свой тип клеток крови, что позволяет предположить наличие наследуемой эпигенетической программы для каждой субпопуляции.

Область и перспективы применения

Для лечения анемии в 1988 году во Франции были впервые применены стволовые клетки

Высокоэффективное лечение стволовыми клетками опухолей, инсультов, инфарктов, травм, ожогов, заставило создавать в развитых странах специальные учреждения (банки) для хранения замороженных стволовых клеток в течение долгого времени.

В такой коммерческий именной банк крови уже сегодня возможно, по заказу родственников, поместить пуповинную кровь ребенка, с тем, чтобы в случае его травмы, болезни, была возможность использовать собственные стволовые клетки.

Пересадка внутренних органов восстанавливает здоровье человека только в том случае, если она проведена своевременно, и не произошло отторжение органа иммунной системой пациента.

Примерно 75 % пациентов, нуждающихся в пересадке органов, погибает в период ожидания. Стволовые клетки могут стать идеальным источником «запасных частей» для человека.

Уже сегодня – спектр применения стволовых клеток в лечении самых тяжелых заболеваний очень широк.

Восстановление нервных клеток позволяет восстановить капиллярное кровообращение и вызвать рост капиллярной сети на месте поражения. Для лечения повреждённого спинного мозга используют введение нервных стволовых клеток, либо чистые культуры, которые затем превратятся на месте в нервные клетки.

Некоторые формы лейкозов у детей стали излечимы благодаря достижениям биомедицины. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток применяется в современной гематологии, а трансплантация стволовых клеток костного мозга – в широкой клинике.

Исключительно сложны в лечении системные заболевания, вызванные нарушением функций иммунной системы: артриты, рассеянный склероз, красная волчанка, болезнь Крона. Гемопоэтические стволовые клетки применимы и при лечении этих заболеваниях

Имеется практический клинический опыт в применении нейральных стволовых клеток при лечении болезни Паркинсона. Результаты превосходят всякие ожидания.

Мезинхимальные (стромальные) стволовые клетки уже используют в ортопедической клинике несколько последних лет. С их помощью восстанавливают разрушенные суставные хрящи, костные дефекты после переломов.

Кроме того, эти же клетки в последние два-три года используют методом прямого введения в клинике восстановления сердечной мышцы после инфаркта.

С каждым днем пополняется список болезней, которые поддаются лечению стволовыми клетками. И это даёт надежду на жизнь неизлечимым больным.

Список заболеваний, при лечении которых используются стволовые клетки

Доброкачественные заболевания:

адренолейкодистрофия;

анемия Фанкони;

остеопороз;

болезнь Гюнтера;

синдром Харлера;

талассемия;

идиопатическая апластическая анемия;

рассеянный склероз;

синдром Леш-Нихана;

амегакариоцитозная тромбоцитопения;

синдром Костмана;

волчанка;

резистентный ювенильный артрит;

иммунодефицитные состояния;

болезнь Крона;

синдром Бара;

коллагенозы.

Злокачественные заболевания:

неходжкинская лимфома;

миелодиспластический синдром;

лейкемия;

рак молочных желёз;

нейробластома.