Для нуклеиновых кислот широко применяется метод гель-электрофореза. Его принцип заключается в следующем. Исследуемый препарат (раствор ДНК или РНК) вносят в лунку, расположенную у края геля.
Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, и когда через гель пропускают электрический ток они перемещаются в электрическом поле.
Для учета результатов выделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели в присутствии специфического красителя (как правило, бромистый этидий или SYBR Green I). Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований) денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20 % полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом.
Детекция НК основана на использовании интеркалирующих веществ, активирующих свою способность к флуоресценции в результате присоединения к ДНК или РНК. В качестве основного представителя применяется бромистый этидий и SYBR Green I. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия под действием ультрафиолетового излучения значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Однако он способен взаимодействовать и с молекулами РНК, но менее интенсивно.
Для разделения нуклеиновых кислот применяют различные концентрации геля, в зависимости от длины исследуемой НК. Диапазон нормального разделения линейных ДНК молекул для гелей с различной концентрацией агарозы.
Метод горизонтального электрофореза.
Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (рис. 38). Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в концентрации 0.8-2% с добавлением специального красителя ДНК, - например, бромистого этидия.
Рис. Детекция нуклеиновых кислот в геле.
Застывшая агароза образует пространственную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения (рис. 39). Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра (590 нм). Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Кроме того, используют способы детекции: Cresol red, Tetrazine dye yellow food coloring (Schilling Brand), ксиленцианол, бромфеноловый синий, метод гибридизационных зондов.
Рис. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.
Метод вертикально гоэлектрофореза.
Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид (рис. 40). Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом.
Рис. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле в вертикальной камере.
Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле
1. Взвесить необходимое количество агарозы (ее количество зависит от концентрации используемого геля).
2. Долить 1х ТАЕ буфер до нужного объёма (можно использовать концентрированный – 50х ТАЕ – буфер (2М Tris-HCI, 5.71 % ледяной уксусной кислоты, 2мМ EDТА, довести рН до 8.5).
3. Довести до кипения, кипятить до полного растворения агарозы.
4. Остудить до 50–60oС (можно держать банку в руках), добавить бромистый этидий до концентрации 0,1 %.
5. Залить форму, дать агарозе застыть в течение 0.5–1 часа.
6. В кармашки внести образцы НК, предварительно добавив буфер для электрофореза (0.1% бромфеноловый синий, 0.1% ксиленцианол, 60% глицерин, 60мМ ЭДТА).
7. Нагрузка выбирается из расчета 6–10 В на 1 см геля.
Анализ результатов электрофореза
Анализ результатов на гелевой пластинки после проведения электрофореза осуществляется на основе расчета относительной электрофоретической подвижности (Rf) образцов.
Электрофоретическая подвижность является величиной, характерной для данного вещества. Различают абсолютную и относительную электрофоретическую подвижность. Абсолютная электрофоретическая подвижность, формирующаяся под влиянием внешнего электрического поля, измеряется в сантиметрах в секунду. Относительная электрофоретическая подвижность представляет собой отношение подвижности исследуемого вещества к подвижности другого вещества, принятого за стандарт.
Электрофоретическая подвижность заряженной частицы непосредственно связана с величиной заряда и обратно пропорциональна размеру частицы, непосредственно связанному, в свою очередь, с ее молекулярной массой.
Для расчета относительной электрофоретической подвижности применяют следующую методику:
Rf = L / L1,
где L – расстояние, пройденное от линии старта образцом (мм); L1 – расстояние, пройденное от линии старта маркером или общее расстояние гелевой пластинки (мм).
Рис. Определение параметров при электрофоретическом исследовании.