зучение патологических процессов на клеточном и тканевом уровне производится при помощи микроскопических исследований. Гистологический метод исследования необходим для изучения строения и функции клеток в состоянии нормы, патологии и экспериментальном периоде. Для гистологического исследования берутся элементы тканей и органов. Толщина исследуемого образца не может превышать 1 см3.
Образцы тканей могут браться у человека сразу после смерти (чем быстрее, тем лучше) – аутопсия. Также материал может браться во время операции или непосредственно в диагностических целях при помощи специальных инструментов – биопсия.
Приготовление образцов
Приготовление образцов происходит в несколько этапов:
Фиксация материала.
Приготовление среза.
Процесс окрашивания среза.
Суть фиксации материала заключается в остановке естественных процессов в тканях и клетках. Это необходимо для того, чтобы во время купировать процесс гниения и ферментативные изменения в структуре тканей.
В фиксируемых тканях за счет физико-химических процессов происходит свертывание (коагуляция) белков и липоидной составляющей. Это состояние позволяет тканям долго храниться в неизменном виде, без реакции на различные воздействия. Проще говоря, фиксация тканей проводится с целью сохранения прижизненной структуры биологического материала.
Для фиксации тканей применяются специальные жидкости (фиксаторы). Наиболее популярными фиксаторами можно назвать следующие варианты жидкостей:
Формальдегид.
Спирт (96, 100%).
Осмиевая кислота.
Выше перечислены простые фиксаторы. Также для фиксации тканей применяются более сложные варианты фиксаторов (растворы):
Спирт-формол.
Жидкость Ценкера.
Двухромовоокислый калий.
В списках указаны лишь некоторые виды применяемых фиксаторов. Продолжительность необходимого для фиксации образцов тканей периода может варьироваться от нескольких часов до суток. Длительность зависит от особенностей исследуемых образцов и типа выбранного фиксатора. После того как этап фиксации пройден необходимо произвести промывку материала (в течение нескольких часов) в проточной воде. Это делается для того чтобы освободить образцы от излишков фиксирующей жидкости и осадочной взвеси.
Мутные непрозрачные образцы не подходят для исследования. Такие кусочки материала не позволят получить необходимую информацию. Перед тем как приступить к одному из главных этапов – осуществлению среза, образцы промываются чистой водой в течение нескольких часов. Далее, материал подвергается процессу обезвоживания. Обезвоживание осуществляется при помощи проведения тканевого образца через спирты возрастающей крепости. Этот этап длительный. В каждом спирте кусочки материала находятся от 2-3 часов до суток.
После обезвоживания проводится заливка образцов. Этот этап необходим для уплотнения тканей и получения качественных блоков для исследования. Уплотнение проводится путем замораживания (срочная биопсия) или путем заливки парафином или целлоидином. Заливка парафином - достаточно длительная процедура (от 24 часов и дольше). Такой вариант уплотнения образцов используется для осуществления исследования в обычном режиме. Для лучшей визуализации отдельных структур тканей срезы окрашивают. Для окрашивания применяют специальные гистологические красители (кислые, основные, специальные).
Подготовленные к изучению образцы исследуют при помощи специального микроскопа.
Прежде чем приступить к изучению гистологического препарата необходимо убедиться, что последний полностью соответствует ряду обязательных требований:
В материале должны быть сохранены прижизненные структуры.
Срез должен быть тонким и прозрачным.
Структуры, которые требуется подвергнуть изучению должны быть четко визуализированы за счет окрашивания.
Препараты должны иметь длительный срок хранения.
При качественном приготовлении препарата достичь соответствия всем перечисленным требованиям достаточно просто. Однако нельзя исключить возможность возникновения небольших погрешностей. Если вовремя распознать некоторые виды неточностей, купировать брак, создать качественный материал вполне возможно.
Самыми распространенными погрешностями при приготовлении срезов можно назвать следующие варианты:
Крошение среза.
Выпадение материала из парафиновой массы.
Невозможность нарезки материала.
Разрыв материала.
Те или иные погрешности могут возникать по разным причинам. Иногда в основе нарушения качества образца лежат ошибки во время изготовления. Для устранения каждой погрешности предусмотрены определенные алгоритмы действий.