А. Ю. Ермолина
alexandra27e@yandex.ru
магистрант 2 курса напр. «Технология молока и
молочных продуктов», Вологодская ГМХА,
И.С. Полянская
доц, к.т.н..,
Вологодская ГМХА,
г. Вологда
ОБНАРУЖЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ГЕННО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ
Аннотация: Исследование продуктов на содержание генно-модифицированных компонентов задача актуальная, поскольку безопасность таких продуктов для будущих поколений не является доказанной и бесконтрольное использование ГМО заботит многих потребителей. В обзоре представлены современные методы исследований в области обнаружения ГМО и перспективы их развития.
Ключевые слова: биотехнология, генно-модифицированные организмы (ГМО), рекомбинантная ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), биологический микрочип
Применение биотехнологий в сфере производства пищи при условии контролировании генно-инженерной деятельности считается исключительно перспективным направлением [1].
Пищевая продукция, полученная с использованием современных биотехнологий, c целью реализации прав потребителей на объективную информацию, в большинстве стран мира подлежит контролю. В частности кукуруза Starlink с рекомбинантной ДНК не разрешена для употребления в пищу человеком, т.к. не решена проблема её потенциальной аллергенности [2], однако в 2000 г. из реализации в США отозвано более 300 продуктов из такой кукурузы, что побудило к совершенствованию методов контроля генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО).
Аналитические методы, используемые для этих целей, многочисленны. Выбор методов основан на специфичности, чувствительности, практичности при проведении анализа. В качестве мишени для определения ГМО используется белок, определяющий заданный в ходе генетической трансформации признак, или рекомбинантная ДНК [1, 2, 3].
Обнаружение компонентов генно-модифицированных компонентов (микроорганизмов, белков) в продуктах имеет существенные сходства с определением пищевых аллергенов и проводится иммунохимическими методами, методами ДНК-ДНК полимеризации, ПЦР-диагностики и др. [2-7]. Многие методы являются качественными, т.к. сильно зависят от точности воспроизведения пищевого матрикса, подготовки проб, стандартизации получения антител и др. Чувствительность различных количественных методов колеблется от 0,1 до 1000 нг/мл [4].
Иммунохимический метод (иммуноферментный анализ) основан на применении для выявления конкретных белков в сложных пищевых матриксах специфических антител. Методы определения экспрессированного белка имеют целый ряд преимуществ, которые связаны с достаточно простым форматом и относительно низкой стоимостью анализа по сравнению с другими методами (рис. 1). Однако эти методы могут рассматриваться только в качестве альтернативного подхода для определения ГМО. Иммуноферментный анализ из-за нестабильности белкового субстрата пригоден только для растительного сырья и технологически не обработанной пищи и не пригоден для анализа пищевых продуктов, при производстве которых исходное сырье подвергается значительной технологической обработке (высокая температура, кислая среда, ферментативная обработка и др.).
Размер частиц исследуемого продукта при использовании тест-наборов иммуноферментного анализа имеет существенное значение, так изменчивость данных для муки грубого помола почти в два раза выше, чем для муки тонкого помола [8].
Методы, основанные на основе анализа рекомбинантной ДНК, не анализируют непосредственно белок, а выявляют контролирующий этот белок ген (рис. 2).
ДНК является более стабильной и предпочтительной мишенью при определении ГМО. Для определения рекомбинантной ДНК в пищевых продуктах применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который обладает большей чувствительностью по сравнению с иммуноферментным анализом. Этот метод позволяет идентифицировать ГМО в пищевых продуктах на нескольких уровнях специфичности [1].
К первому уровню (с наименьшей специфичностью) относят методы, основанные на определении нуклеотидных последовательностей, регулирующих работу гена, кодирующего новый признак, что позволяет проводить широкие скрининговые исследования пищевых продуктов. Для рутинного скрининга в качестве мишени чаще используют промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты или рекомбинантной ДНК nopaline synthase из Agrobacterium tumefaciens.
Ко второму уровню (средней специфичности) относят методы ПЦР, позволяющие выявлять непосредственно смысловой ген или генетическую конструкцию. ПЦР-диагностика (метод на основе полимеразной цепной реакции) помогает выявить ничтожно малое содержание модифицированного гена в продукте, т.к. предполагает повышение общей чувствительности анализа посредством предварительной многократной ампфликации материала.
Для количественного анализа применяется ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией результатов. Преимуществом этого метода является определение продуктов ПЦР непосредственно в ходе реакции, метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью, отсутствием контаминации продуктами ПЦР, значительной экономией лабораторной площади и меньшей продолжительностью анализа.
Однако несмотря на то, что ДНК более стабильна по сравнению с белком, она также может разрушаться под действием высоких температур, облучения ультрафиолетовым светом, обработки кислотами и ферментами, специфично оказывающими воздействие на ДНК. Так, даже в случае выделения достаточно большого количества ДНК амплификация может не пройти из-за присутствия в продукте только очень коротких нитей ДНК. Критический размер ДНК-фрагментов для выявления методом ПЦР составляет 400 пар нуклеотидов [10]. Установлено, что ДНК не определяется в пищевых продуктах, подвергшихся значительной технологической обработке: гидролизованные растительные белки, рафинированные масла, соусы, сахар и этиловый спирт, которые потенциально могут быть произведены из генно-инженерно-модифицированных растений [1]
К третьему уровню идентифицировать ГМО в пищевых продуктах относят использование ДНК-технологий с применением биологических микрочипов. Будущее представляется за инновационными высокоскрининговыми и высокоэкспессивными методами с применением биологических микрочипов (например, микроматриц) что позволяет выполнять анализ сразу многих генно-модифицированных компонентов в одном образце или анализ сразу нескольких тысяч образцов с минимальным расходом реагентов [1, 3].
В качестве мишени для выявления продукции, произведенной из ГМО, могут служить не только рекомбинантная ДНК, экспрессированный белок, определяющий заданный признак, но и вещества, количество которых изменено в результате генетической трансформации [1]. В последнем случае для выявления генетических модификаций могут применяться химические методы анализа: хроматография, спектрофотометрия, спектрофлюориметрия. В качестве примера можно привести генетически модифицированные линии сои с повышенным содержанием олеиновой кислоты до 83,8% по сравнению с традиционным аналогом, содержащим 23,1%.
Применение в данном случае хроматографических методов позволяет выявить генетическую модификацию даже в таких продуктах, где ДНК и белок отсутствуют, например, в рафинированном соевом масле.
| 
|
| Рис. 1. Тест-ситема иммуноферментного анализа ГМО Sintol [8] | Рис. 2. Гель-электрофорез – заключительный этап методов ДНК-диагностики аллергенов [6] |
В Российской Федерации в соответствии с Федеральным законом от 25.10.2007 г. № 234-ФЗ пищевая продукция, содержащая более 0,9% ГМО, подлежит обязательному этикетированию В нашей стране в настоящее время является стандартным и применяется на практике комплексный метод идентификации ГМО растительного происхождения включающий проведение асимметричной мультипраймерной ПЦР, гибридизацию и ферментный анализ продуктов амплификации на биологическом микрочипе с последующей детекцией на аппаратнопрограммном комплексе "Дегмиген-001" [11]. Высокая чувствительность метода позволяет улавливать содержание ГМО в исследуемых пищевых продуктах от 0,1% [1].
В молочной промышленности для контроля использования генно-модифицированных микроорганизмов используется стандартный метод [12] предусматривающий экстракцию нуклеиновых кислот и выполнение аналитических процедур, например, ПЦР. При этом из йогуртов, подвергнутых термической обработке, также экстрагируется ДНК, пригодная для ПЦР.
Литература и примечания:
[1] Чернышева О.Н., Сорокина Е.Ю. Методы аналитического контроля пищевой продукции, произведенной из генноинженерно-модифицированных растений // Вопр. питания. - 2013. - № 3. - С. 53-60.
[2] Pesticides: Regulating Pesticides / US Environmental Protection Agency. – 2015. – Jan. https://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/index.htm(Accessed 05.11.2018).
[4] Anklam E. et al. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products // European Food Research and Technology/ - 2002. – 214. – P. 3-26.
[5] Stave J.W. Protein immunoassay methods for detection of biotech crops: Applications, limitations, and practical considerations // J. of AOAC Intern. – 2002. – 85. – P. 780-786.
[6] Семёнова В.И., Полянская И.С. Определение пищевых аллергенов и ГМО в молокосодержащих продуктах питания // Современная наука: новые подходы и актуальные исследования. - Прага. 2018. – С. 135-141.
[7] Методы анализа пищевых продуктов. Определение компонентов и пищевых добавок. Элтеш С (ред.-сост.) – пер. с англ. СПБ.: Профессия, 2016. – 564 с.
[8] Whitaker T.B. et al. Evaluation of sampling plans to detect Cry9C protein in com flour and meal // J. of AOAC Intern. – 2004. – 87. – P. 950-960.
[9] Анализ генетически-модифицированных организмов (ГМО) [электронный ресурс] // https://www.ld.ru/PCR/ilist-4315.html(дата обращения 05.11.2018 г.). – Заглавие с экрана.
[10] Lipp M., Shillito R., Giroux R. et al. // J. AOAC Int. - 2005. - Vol. 88, N 1. - P. 136-150.
[11] ГОСТ 34150-2017 Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с применением биологического микрочипа.
[12] ГОСТ Р ИСО 21571-2014 Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов.
@ А. Ю. Ермолина, И.С. Полянская, 2018