После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших исследований необходимо определить чистоту препаратов и размер молекул. Загрязняющие примеси в препаратах нуклеиновых кислот могут ингибировать последующие ферментативные реакции с их участием (например, рестрикцию ДНК). ДНК и РНК (одно- и двухцепочечные) движутся в геле со скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее, чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса нуклеиновых кислот пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния, на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма длины этого фрагмента, и с её помощью определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются.
Геномная ДНК при проведении электрофореза характеризуется гомогенной полосой в верхней части геля (рядом с лунками для нанесения).
Качество РНК после проведения электрофореза оценивают по соотношению интенсивности полос, соответствующих 18S и 28S рРНК. При хорошем качестве выделенной РНК соотношение интенсивности полос 18S и 28S должно быть не менее 1:1. Изменение соотношения в пользу 18S РНК свидетельствует о частичной деградации образца.
Следует сказать, что у ряда беспозвоночных видна только одна полоса рРНК на уровне 18S. У некоторых организмов, например, простейших, рРНК сегментирована; в этом случае суммарная РНК на электрофореграмме выглядит как шмер в области 2-3 т.п.н.
Если РНК имеет длину меньше ожидаемой или выглядит деградированной по данным электрофореза, необходимо проверить чистоту и качество реагентов для выделения РНК и повторить выделение.
Частично деградированную РНК иногда используют для синтеза кДНК, в частности, когда нет возможности повторно провести выделение РНК. Однако следует иметь в виду, что количество полноразмерных последовательностей кДНК в таком образце снижено. Особенно это относится к протяженным молекулам. Препарат суммарной РНК часто содержит примесь геномной ДНК, которая на электрофореграмме выглядит как шмер высокомолекулярной фракции (в виде облака или полосы в области лунки). Как правило, примесь геномной ДНК не влияет на качество синтеза кДНК с использованием олиго(dT)-содержащего праймера. Но при слишком высокой ее концентрации в препарате РНК реакция синтеза кДНК может пройти менее эффективно. Избыток геномной ДНК может быть удален переосаждением образца 12М LiCl или дополнительной очисткой на колонке. В некоторых протоколах рекомендуется избавляться от фракции геномной ДНК с помощью обработки ДНКазами или дополнительной экстракцией кислым фенолом, что приводит к частичной деградации ДНК, но сохраняет РНК. Однако короткие фрагменты деградированной ДНК, которые остаются в препарате, могут выступать как случайная затравка для РНК-зависимой ДНК-полимеразы при синтезе первой цепи кДНК, и это снижает эффективность последующей амплификации кДНК. После анализа оценки качества препарата РНК можно переходить к процедуре синтеза кДНК.
Материалы и оборудование:
Камера для электрофореза, штатив для приготовления гелей, гребёнки, источник тока, трансиллюминатор, 50Х ТАЕ-буфер, агароза, колба на 100 мл, дистиллированная вода, раствор бромистого этидия в воде (1%), буфер для нанесения (0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилен цианол в 30%-ном глицерине), продукты ПЦР или изолированная РНК, маркер молекулярного веса.
Ход работы:
1. Взвесить 0,6 г агарозы и поместить в колбу на 100 мл. Добавить в колбу 30 мл дистиллированной воды и 600 мкл 50Х TAE-буфера. Довести смесь до кипения.
2. После того, как смесь остынет до 70-60°С, внести в расплавленный гель 3 мкл бромистого этидия.
3. Залить гель в заранее приготовленный штатив. После застывания геля перенести его в электрофорезную камеру. Плавить гель до однородного состояния можно на водяной бане или в микроволновой печи, далее залить гель в электрофорезную камеру. При помощи гребёнки сформировать карманы для нанесения образца необходимого объёма. После полимеризации геля заполнить камеру 1Х ТАЕ буфером, удалить гребёнку.
4. Смешать образцы с буфером для нанесения (3:1) и внести в лунки. В одну из лунок нанести маркер молекулярного веса.
5. Провести электрофорез при напряжении 7 В/см. Об успешности разделения фрагментов можно судить по движению в геле красителей, являющихся компонентами буфера для нанесения. Когда бромфеноловый синий пройдёт около 2/3 длины геля, можно приступать к визуализации ДНК.
6. Провести визуализацию результатов на трансиллюминаторе при длине волны 312 нм.
Примечание
В буфере, который заливают в камеру, как и в самом геле, присутствует бромистый этидий (Ethidium bromide) - флуоресцентный краситель для окрашивания ДНК. Он мутагенен, поэтому при работе с ним следует надевать перчатки.
При освещении ультрафиолетовым светом бромистый этидий флуоресцирует оранжевым цветом, интенсивность флюоресценции увеличивается примерно в 20 раз при его связывании с ДНК.
Примечание
Ультрафиолетовый свет вреден для зрения, поэтому необходимо работать с защитным экраном. В качестве альтернативы могут быть использованы специальные очки.