О присутствии патогенных свойств у выделенных культур судят по биохимическим признакам, перечисленным в таблице 2, кроме того, по результатам биопробы, позволяющих, в том числе, доказать наличие летального токсина и некротоксина. Известно шесть антигенноразличных энтеротоксинов (А, В, С, D, Е, F). Летальный токсин определяю путем внутривенного введения кролику фильтрата бульонной культуры. Дермонекротическую пробу проводят при подкожном введении кролику. В результате, на 1 сут. Кода краснеет, на 2 сут. – темнеет и некротизирует.
Таблица 1 - Дифференциация стафилококков от других
грамположительных кокков
| Признаки | Стафилококки | Микрококки | Энтерококки | Стрептококки |
| Ферментация глюкозы (ОФ-тест) | + | - | + | + |
| Каталаза | + | + | - | - |
| Оксидаза | - | + | - | - |
| Коагулаза | + | - | - | - |
| Чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД/диск) | - | + | - | - |
Коагулаза. Реакция с плазмой кролика.Положительный результат – образование сгустка, который при наклоне пробирки удерживается. Стафилококки с выраженной патогенностью свертывают плазму в сроки до 2 часов. Наличие коагулазы наиболее четко коррелирует с патогенностью стафилококка.
Рис. 6 Набор для определения коагулазной активности
Фибринолизин (стрептокиназа). Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляшки» на агар с 12 % цитрированной плазмой. Посевы инкубируют при 37 °С 23–24 ч. Положительный результат – появление зоны просветления вокруг колонии.
Протеин «А». Белковое вещество, которое часто обнаруживают на поверхности клетки S. aureus и S. hyicus, обладает способностью неспецифически связывать Fс-фрагменты молекул JgG. За счет протеина «А» стафилококков происходит агглютинация эритроцитов, содержащих на своей поверхности JgG (гемолизин).
Лецитиназа. Фермент бактерий, расщепляющий лецитин, выявляют путем посева культуры стафилококков на желточный агар. Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37–38 °С 24–48 ч. Положительный результат – появление зоны помутнения вокруг колоний.
Рис. 7 Лецитиназная активнсть культуры стафилококка на желточном агаре. Зона помутнения вокруг колоний
Гемолизины. Гемолитическую активность исследуют посевом на кровяной агар. Гемолизины стафилококков отличаются биохимическими, антигенными свойствами и литической активностью по отношению к эритроцитам различных видов животных. Известны четыре типа гемолизинов стафилококков.
Определенный штамм стафилококков может синтезировать один тип гемолизина или несколько в различных комбинациях. S. aureus, S. intermedius могут синтезировать одновременно α- и β-гемолизин, что приводит к образованию двойной зоны гемолиза: вблизи колонии – типа α (узкая полная), далее – β (широкая).
Рис. 8 Гемолитическая активность стафилококков. Зона гемолиза вокруг колоний
ДНК-аза. Нуклеаза обычно выявляется у S. aureus, S. intermedius, S. hyicus. Исследуемую культуру бактерий засевают на питательный агар с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положительный результат – при гидролизе ДНК вокруг выросшей культуры видна светлая зона.
Рис. 9 ДНК-азная активность культуры стафилококка на ДНК-агаре
Таблица 2 - Биохимические признаки и другие свойства
стафилококов, выделяемых от животных
Идентификация стафилококков с использованием
СТАФИ теста
Набор СТАФИ тест предназначен для идентификации широкого ряда стафилококков и родственных грамположительных кокков (Мicrососus, Stomatococcus и др.).
Система представляет собой планшет, содержащий 6 двухрядных вертикальных стрипов с субстратами для определения 16 тестов: уреаза, аргинин, орнитин, бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, нитраты, фосфатаза, пирролидонилариламидаза, эскулин, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, мальтоза, манноза, глюкоза/новобиоцин. Дополнительно к планшетным рекомендуются бумажные полоски для определения реакции Фогеса-Проскауэра (ВПтест) и определения цитохромоксидазы (ОКСИ-тест). Набор содержит 10 пластинок и позволяет провести идентификацию 60 культур.
Таблица 5 - Интерпретация реакций
| Колонка | Тест | Код | Результат (цветовая реакция) | ||||||
| Положительный | Отрицательный | ||||||||
| Ряд 1-й | |||||||||
| Н | Уреаза | URE | Красно-фиолетовый, оранжево-красный | Желтый, бледно-оранжевый | |||||
| G | Аргинин | АRG | Красно-фиолетовый, красный | Желтый, бледно-оранжевый | |||||
| F | Орнитин | ОRN | Красно-фиолетовый, красный | Желтый, бледно-оранжевый | |||||
| Е | Бета-галактозидаза | ОNP | Желтый, бледно-желтый | Бесцветный | |||||
| D | Бета-глюкуронидаза | GLR | Желтый, бледно-желтый | Бесцветный | |||||
| С | Нитраты | NIT | Темно-красный, красный | Бесцветный, слабо-розовый | |||||
| В | Фосфатаза | РHS | Красно-фиолетовый | Бесцветный, слабо-розовый | |||||
| А | Пирролидо-ниламидаза | РYR | Красный, бледно-красный | Желтый, желто-оранжевый | |||||
| Ряд 2-й | |||||||||
| Н | Эскулин | ЕSL | Черный, темно-коричневый, темно-серый | Бесцветный, бледно-коричневый, бледно-серый | |||||
| G | Сахароза | SUC | Желтый, желто-коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
| F | Трегалоза | ТRЕ | Желтый, желто -коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
| Е | Маннитол | МАN | Желтый, желто-коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
| D | Ксилоза | ХYL | Желтый, желто-коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
| С | Мальтоза | MLT | Желтый, желто-коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
| В | Манноза | МNZ | Желтый, желто-коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
| А | Глюкоза/ ново-биоцин | GLN | Желтый, желто-коричневый | Фиолетовый, коричнево-фиолетовый | |||||
Рис. 10 Идентификация стафилококков в СТАФИ тесте
Диагностика стрептококкозов и энтерококковой инфекции
Диагностика стрептококкозов проводится комплексно, учитывают эпизоотологические, данные, клинические признаки, патологоанатомические изменения и лабораторные исследования.
Ранее в род Streptococcus включали пиогенные стрептококки, энтерококки и молочнокислые стрептококки, которые в настоящее время отнесены соответственно в самостоятельные роды Streptococcus, Еnterococcus и Lactococcus.
Виды рода Streptococcus имеют клетки сферические или овальные, диаметром 0,5–2 мкм, при росте в жидкой питательной среде клетки парные или в виде цепочек. Клетки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, иногда имеют капсулу. Факультативные анаэробы, каталазоотрицательные, растут в диапазоне температур 25–45° С.
Виды рода Еnterococcus сходны со стрептококками по вышеперечисленным признакам, но температурный диапазон составляет 10–45° С, могут расти при рН 9,6, концентрации NаС 16,5 % и желчи 40 %, обычно относятся к серологической группе «В». Энтерококки (Е. faecalis, E. faecium, E. durans) обитают в кишечном тракте многих видов животных, могут быть причиной оппортунистических инфекций и септицемии у кур, маститов коров, инфекций мочевого тракта у собак, эндокардитов у ягнят и крупного рогатого скота.
Таблица 3 - Экология и патогенные свойства стрептококков
| Вид стрептококка | Естественная среда обитания | Вызываемая патология |
| S. рneumoniае | Верхние дыхательные пути | Септицемия, воспаление суставов, при подостром течении пневмония, воспаление кишечника у телят, ягнят, реже у поросят |
| S. руoqenes | Верхние дыхательные пути | Иногда маститы у коров, лимфангит жеребят |
| S. equi sudsp. equi | Миндалины лошадей | Лошади – маститы, мыт |
| S. equi sudsp. equisimilis | Влагалище и кожа лошадей | Маститы, эндометриты лошадей |
| S. equi zooepidemicus | Слизистые и кожа свиноматок, овец, кур и кожа лошадей | Крупный рогатый скот – маститы и метриты; свиньи – септицемия и артриты у 1-3-недельных поросят; ягнята – пневмонии; птица – септицемия; лошади – аборты, маститы, пневмонии |
| S. agalactiae | Молочные каналы | Крупный рогатый скот, овцы, козы – маститы; собаки – септицемия щенков; кошки – маститы |
| S. dysagalactiae | Гениталии и носовая полость крупного рогатого скота, овец | Крупный рогатый скот – маститы, эндометриты; ягнята – полиартриты |
| S. uberis | Миндалины, влагалище, кожа крупного рогатого скота | Крупный рогатый скот – маститы |
| S. canis | Слизистые, генитальный тракт плотоядных | Плотоядные – септицемия новорожденных, поражения гениталиев, кожи |
| S. bovis, S. equines 2 | Кишечный тракт многих видов животных | Возбудители оппортунистических инфекционных болезней |
Патматериал. Для исследования на стрептококкоз животных в лабораторию направляют кровь сердца, печень, селезенку, головной мозг и трубчатую кость. При пневмониях дополнительно берут кусочки легкого на границе здоровой и пораженной тканей, средостенные лимфатические узлы, при артритах – синовиальную жидкость. Трупы мелких животных доставляют целиком. В случае маститов направляют секрет пораженной доли вымени, эндометритов – содержимое влагалища, взятое при помощи стерильных тампонов.
В связи с малой устойчивостью возбудителя материал должен быть доставлен не позднее 6 часов после гибели или убоя животного при условии транспортировки его в термосе со льдом (4–6°С). При более высокой температуре срок доставки материала не должен превышать 2–3 часа.
Микроскопия. Готовят мазки, окрашивают по Граму, при подозрении на наличие капсулообразующих стрептококков препараты окрашивают на капсулы по Романовскому-Гимза, Ольту и др. Мазки из молока можно окрашивать по Граму.
Клетки S. рneumoniае в окрашенных препаратах овальные или сферические, размером 0,5–1,25 мкм, обычно парные, причем со-прикасающиеся стороны клеток уплощены, а наружные вытянуты и заострены (ланцетовидный диплококк). Также клетки могут располагаться одиночно, короткими цепочками, окружены капсулой.
Клетки S. equi сферической или овальной формы, размером 0,6–1,0 мкм, располагаются одиночно, парами, короткими цепочками, в мазках из гноя в виде длинных цепочек, имеют капсулу.
Клетки S. agalactiae (S. dysagalactiae) сферические, размером 0,6–1,2 мкм, чаще располагаются в виде коротких или средней длины цепочек.
Клетки S. руogenes сферические, размером 0,5–1,0 мкм, в виде коротких или длинных цепочек (в бульоне длинные цепочки).
Энтерококки имеют овальную форму, размер 0,6–2,0 х 0,6–2,5 мкм, располагаются парами или короткими цепочками.
Результаты микроскопического исследования, с учетом полиморфизма бактерий на фоне лекарственной терапии, имеют ориентировочное диагностическое значение.
Рис. 11 Схема лабораторной диагностики стрептококкозов
| Патматериал | ||||||||||||||||||||||||||
| Микроскопия, окраска мазков про Граму | Первичный посев на МПА с 1% глюкозы и 5-10% крови | Биопроба внутри- брюшинно 3 белым мышкам по 0,5 мл | ||||||||||||||||||||||||
| Выделение чистой культуры и ее идентификация (МПА, микроскопия) | ||||||||||||||||||||||||||
| Лизис с 10% желчью + | Рост на среде с 40% желчью - | Рост на среде с 6,5% NaCl + | Ферментативные свойства | Редукция метиленовой сини - | Терморезистентность - | |||||||||||||||||||||
| Раффиноза - | Сорбит + | Маннит + | ||||||||||||||||||||||||
Рис. 12 Возбудитель пиогенного стрептококкоза. Str. piocenes
Рис. 13 Возбудитель гнойного мастита Str. agalactiae
Рис. 14 Возбудитель мыта лошадей. S. equi
Рис. 15 Мыт лошади
Рис. 16 Возбудитель диплококковой септицемии. Str. pneumoniae
Культивирование. Стрептококки – факультативные анаэробы. Исследуемый материал высевают на кровяной, глюкозо-кровяной агар (кровь барана или крупного рогатого скота), глюкозо-сывороточный МПБ (рН 7,4–7,8). Контаминированный материал засевают на селективные среды: агар с антибиотиками, азидом натрия; образцы молока целесообразно высевать на среду Эдварда для выявления гемолиза и гидролиза эскулина.
Для обнаружения энтерококков используют специальные селективные среды: молочно-полимиксиновая среда Калины, желчно-кровяной агар Беленького и др. Посевы инкубируют при 37–38° С в течение 24–48 часов.
Культуральные свойства. На глюкозо-кровяном агаре стрептококки в основном растут в виде мелких, прозрачных или слегка мутноватых колоний с ровными краями, как правило окруженных зоной гемолиза. Различают α- и β-гемолитические стрептококки. В сывороточно-кровяном бульон чаще растут с равномерным помутнением и выпадением крошковатого или пылевидного осадка.
Рис. 17 Streptococcus agalactiae. Глюклзно-кровяной агар
Использование специальных дифференциально-диагностических сред для выделения энтерококков позволяет подавить рост сопутствующей микрофлоры и ориентироваться при отборе необходимых колоний. На молочном МПА с полимиксином колонии энтерококков округлой формы, с ровными краями, блестящей поверхностью, диаметром 1,5–2 мм, с красноватым оттенком и зоной протеолиза на светло-голубом фоне.
На желчно-цитратном агаре энтерококки образуют колонии розово-красного цвета. На теллуритовой среде Е. faecalis растет с образованием колоний черного цвета.
Для определения скрытой гемолитической способности стрептококков ставят САМР-тест, который обычно используют для идентификации стрептококков серологической группы В (S. aqalactiae). На кровяной агар бактериологической петлей по диаметру чашки Петри в виде полоски засевают культуру гемолитического штамма S. aureus, дающего широкую зону неполного гемолиза. Отступив на 1-1,5 мм, перпендикулярно к штриху стафилококка высевают культуры испытуемых стрептококков в виде горизонтальных полосок (3-4 штамма). САМР-позитивные штаммы выделяют диффундирующие метаболиты, которые полностью лизируют клетки эритроцитов в зоне штриха стрептококка, прилегающей к культуре стафилококка, что оценивают, как положительный результат. САМР-тест специфичен не только для S. agalactiae этот феномен и может быть обнаружен у стрептококков серогрупп и Е, Р, К, V, G, F.
Рис. 18 САМР-тест на скрытую гемолитическую активнсть
Идентификация стрептококков и энтерококков на уровне рода. С целью дифференциации от морфологически сходных микрококков и стафилококков проверяют каталазную и оксидазную активность бактерий из подозри тельных колоний. Для дальнейшей работы отбирают колонии каталазо- и оксидазоотрицательных культур, отвивают их глюкозо-сывороточный МПБ, кровяной МПА и подвергают изучению.
С целью дифференциации видов рода Streptococcus и Enterococcus испытуемые культуры засевают в глюкозо-сывороточный бульон с 40% желчи крупного рогатого скота, 6,5% натрия хлорида, а также на бульон обычного состава. Параллельно производят посев на среду Эдварда для выявления гидролиза эскулина. Посевы культивируют при 37-38° С в течение 24 часов, посевы на обычном бульоне выращивают при 45° С. Считается, что для энтерококков и стрептококков серологической группы D характерны рост при 45° С, устойчивость к 40% желчи и гидролиз эскулина, но есть некоторые исключения.
При 45° С растут все виды энтерококков, не размножаются гноеродные стрептококки, но могут расти стрептококки группы D.
Среда с 40% желчи. Кроме энтерококков на ней могут расти S. bovis, S. porcinus, S. suis, a также S. agalactiae и S. equinus (до 90% штаммов) и многие стрептококки ротовой полости.
Среда с 6,5% натрия хлорида. Растут энтерококки. Могут расти до 90% штаммов S. agalactiae, S. porcinus, из стрептококков ротовой полости – S. cricetum, S. sorbinus, среди группы «Другие стрептококки» - S. alactolyticus.
Идентификация стрептококков и энтерококков на уровне видов и серологических групп. Видовую идентификацию стрептококков и энтерококков проводят путем изучения ферментативных характеристик (гидролиз эскулина, расщепление инулина, маннита, раффинозы, салицина, сорбита, лактозы, трегалозы, реакция Фогес-Проскауера), особенностей гемолитической активности (α-, β-гемолиз, САМР-тест), способности к росту на средах с 6,5% натрия хлорида. При этом может быть использован набор тестов, позволяющий дифференцировать основные патогенные виды стрептококков и энтерококков, выделяемых от животных.
Определение серогрупповой принадлежности испытуемой культуры стрептококка проводят в реакции преципитации. Биопробу используют для определения патогенных свойств культур стрептококков, а также для их выделения из контаминированного материала.