Принцип метода: для разделения суммарных цереброзидов и сульфатидов, выделенных из общих липидов, используют различные системы растворителей. Лучшее разделение получается в системе растворителей хлороформ – метанол – вода (60: 35: 8).
Реактивы: 1) система растворителей хлороформ – метанол – вода (60: 35: 8); 2) кристаллический I2; 3) система растворителей хлороформ – метанол – концентрированный NН3 (80: 20: 0,4).
Ход разделения: хроматографическое разделение на тонком слое проводят на пластинках размером (в среднем)13 · 18 см. Сили- кагель (6 г) марки KCK с размером частиц 20–30 мкм тщательно перемешивают в агатовой ступке с 18 мл дистиллированной воды и переносят на пластинки, стараясь, чтобы силикагель равномерно распределился по всей поверхности. Пластинки высушивают при комнатной температуре, поместив их на ровную горизонтальную поверхность. Непосредственно перед хроматографированием пластинки активируют в термостате в течение 1 ч при температуре 110 °С. Hа неостывшую пластинку наносят раствор цереброзидов и сульфатидов, содержащий 100 мкг исследуемого вещества в 0,1 мл. Нанесение проводят стеклянным капилляром в виде отдельных полосок длиной 1,5–2,0 см на расстоянии 1,5 см от края пластинки.
После высыхания нанесенного раствора липидов проводят хроматографическое разделение в камере, предварительно насыщенной смесью растворителей. Когда фронт растворителей достигнет 17,0–17,5 см, пластинки вынимают и высушивают в вытяжном шкафу до полного исчезновения запаха растворителя, а затем проявляют парами йода. Контур полученных фракций обводят тонкой иглой, после улетучивания йода фракции элюируют. Для элюирования используют ту систему растворителей, в которой осуществлялось хроматографическое разделение. Элюаты соответствующих фракций упаривают и проводят их количественное определение.
Идентификацию полученных фракций проводят по стандартам цереброзидов и сульфатидов, по реакциям на галактозу и на сульфатную группу. Экспериментально установлено, что первые две фракции со значениями Rf0,43 и 0,56 являются сульфатидами, а 3, 4 и 5-я фракции представляют собственно цереброзиды.
В системе растворителей хлороформ – метанол – концентрированный NН3 в соотношении 80: 20: 0,4 проводят хроматографическое разделение общей фракции липидов, выделенной методом Фолча и освобожденной от ганглиозидов. При этом происходит отделение сульфатидов от цереброзидов. Из осадка общих липидов головного мозга могут быть выделены две фракции сульфатидов (С1, С2) с величинами Rf0,26 и 0,35 и три фракции цереброзидов (Ц1, Ц2, Ц3) со значениями Rf 0,45; 0,54 и 0,69.
Использованные системы растворителей дают хорошо воспроизводимые результаты. Преимущество второй системы растворителей состоит в том, что в ней достигается отделение сульфатидов от цереброзидов из общей фракции липидов без их предварительного выделения. Это предотвращает неизбежные потери, что особенно важно в опытах с растущими животными, в головном мозгу которых содержание цереброзидов и сульфатидов очень низкое. Однако в этой системе растворителей не удается разделить глюко- и галактоцереброзиды.
Разделение цереброзидов на галакто-
И глюкоцереброзиды методом
Тонкослойной хроматографии
Принцип метода: разделение цереброзидов на галакто- и глюкоцереброзиды основано на различной способности глюкозы и галактозы образовывать боратные комплексы, обладающие различной хроматографической подвижностью.
Реактивы: 1) 1 % раствор Na2В4О7; 2) система растворителей хлороформ – метанол – вода – 15 М NH4OH (280:70:6:1).
Ход работы: на пластинки размером 13 · 18 см наносят 3 г силикагеля KCK, который перемешивают в агатовой ступке с 7 мл 1 % раствора Na2B4О7 и 3–4 мл воды. Пластинки высушивают при комнатной температуре в горизонтальном положении и непосредственно перед использованием активируют в течение 1 ч при температуре 125 °С. Хлороформ-метаноловый раствор цереброзидов наносят на пластинки микрокапилляром и помещают в камеру с указанной системой растворителей. При использовании данного метода общие цереброзиды, выделенные из головного мозга новорожденных и 10-дневных крыс, разделяются на две фракции галактоцереброзидов и одну фракцию глюкоцереброзидов с соответствующими значениями Rf:0,06; 0,14; 0,40. Количественную оценку полученных фракций цереброзидов осуществляют по углеводному компоненту с орцином методом Радина и соавторов, который дает возможность отделить глюкоцереброзиды от галактоцереброзидов при наличии в пробе не менее 40–50 мкг глюкоцереброзидов.