11.4.4.1 Паразит поверхность экспозиции и задний укупорки ССД
По мере того как паразит проникает в клетку-хозяина, большинство МИК исключены из входа в вакуоль и постепенно закрывают за МДж, оставаясь приурочено к части паразита, который все еще выступает из клетки-хозяина (Каррутерсом и Сибли, 1997; Каррузерс и соавт., 1999b;. Гарсиа-Reguet и др, 2000). Как следствие белка MIC укупорки, связывание с фиксированной подложкой приведет
направить локомоции, и связывание с рецепторами клеточной поверхности может привести к проникновению в клетку. Назад, укупорки T.gondii, ССД является актин-зависимый процесс, это означает, что либо актиновые полимеризации или актиновые филаменты необходимы (Jensen и Эдгар, 1976; Ryning и Remington, 1978; Miller и др. 1979; Рассел и Sinden, 1981).
В настоящее время мнения о том, что актомиозин двигатель, расположенном под плазматической мембраной паразита, взаимодействует опосредованно с цитоплазматическими хвостами трансмембранного ССДА и транслокация их к заднему концу паразита (Сиб, 2003; Кили и Soldati, 2004; Soldati и Мейснер, 2004). Таким образом, как иммобилизованный миозина идет вдоль актиновых филаментов, комплексы рецептор МИКА-клеток увенчаны в обратном направлении, и паразит продвигает себя на подложке или в клетку-хозяина. Существенные доказательства этого укупорка модели было получено путем обратных генетическими подходов в Plasmodium. Делеция TRAP С-конец ликвидирует скользя моторики и инвазию клеток (Kappe и др., 1999).
Направленная вторжение и винтовая скольжение моторики выдержаны подключением актомиозинового двигателя с ИМК. Этот дополнительный слой мембраны поддерживаются микротрубочками, которые обеспечивают подачу для действия скользящей спирали и служат в качестве «колеи» для укупоривания реакции. Миозин действительно закреплен во внутренней мембране комплексе пелликулы, и генерирует mechanochemi-кал силы для транслокации нитей актина (Гаскинс и др., 2004). Различные игроки инвазии устройства называются glideosomes. В следующих разделах описаны компоненты glideosome, их происхождение, и как они взаимодействуют друг с другом в создании этого сложного аппарата.
актин При использовании Цитохалазин устойчивых мутантов либо клетки-хозяина или Toxoplasma, Добровольский и его коллеги показали, что динамику актина в тахизоит, но не в клетке-хозяине, являются критическими для вторжения паразитов (Добровольский и Сибли, 1996). Т. гондий имеет единственный обычный ген актина, ACT1, и этот белок был обнаружен биохимически в его мономерной форме, шаровое (G-актин) (Добровольски и др, 1997b.) - т.е.
284 Toxoplasma Секреторные БЕЛКИ И ИХ РОЛИ В инвазии клеток и внутриклеточное ВЫЖИВАНИЕ
извлекаемый в растворимой фракции клеток следующего фракционирования экспериментов. В месте, актиновые филаменты не были обнаружены в физиологических ули-ции в любом Apicomplexa с использованием обычных методов. Неспособность к окрашиванию apicomplexan микрофиламентов с фаллоидином на месте не из-за выходом из строя F-актина связывать фаллоидин, но более вероятно, необычно короткую длину нити (Sahoo и др, 2005 (Schuler и др., 2005);. Schmitz и др., 2005). Пул паразита актина должен существовать под ASSEM-кровоточили форме, как cytochalasins, которые, как известно вмешиваться в основном с актином удлинением, и которые являются эффективными в блокировании движения паразита. Ограничиваются внутренний плазмодий к полимеризации актина была недавно преодолена совместным действием двух не физиологических факторов, gelsolin и фаллоидина (Schuler и др., 2005).
До сих пор, цитоплазматические актиновые филаменты только были визуализированный после лечения паразитов с актиновым филаментом стабилизирующего jasplakinolide лекарственного средства (JAS) (Poupel и Tardieux, 1999; Shaw и Tilney, 1999). В этих условиях, нити актина polymeriza-ция наводятся на апикальном конце подвижных клеток и приводит к видному апикальному выступу актиновой филы-менты (Шоу и Тилните, 1999). Эти нити были хорошо видны, но их полярность не может быть решена. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что Fila-ка может быть очень короткой, и, возможно, испытывает высокую текучесть в связи с обильным наличием факторов актина-деполимеризация (Allen и др., 1997), а также актин полимеризуется только в ответ на передаче сигналов генерируются при взаимодействии субстрата или хост-элементный контакт в момент вторжения. В заключение, с помощью цитоскелета протоколов STABI-LIZING на мембранных экстракцию паразитов и нового изображения с высокой разрешающей способностью низковольтной полевой эмиссией сканирующей электронной микроскопии (LVFESEM), Шаттена и его коллеги смогли визуализировать в первый раз сеть актиновых размера нитей просто ниже клеточная мембрана (Шаттен и др., 2003). Это место идеально подходит для облегчения транслокации клеточной поверхности ССДА.
В отличие от агентов, которые деполимеризации актина (например, cytD) и блокировать все формы моторики, лечение JAS увеличивает скорость Т. гондий скользя моторику, указывая, что оборот нити должен быть
жестко контролируется, чтобы регулировать синхронизацию моторики (Ветцель и др., 2003). Кроме того, полярность нитей актина должна быть заказана для привода unidirec-ционного скольжения, так как лечение JAS индуцирует bidirec-тельные движений обычно не отображаемые тахизоиты (Ветцель и др., 2003).
альдолазы В цитоплазматических хвостах (CD) из MIC2 и TRAP косвенно ассоциируются с актином через альдолаз (Jewett и Сиб, 2003). Как упоминалось ранее, альдолазы является гликолитического фермента, который связывается с актиновых филаментов в пробирке и в естественных условиях (Арнольд и Pette, 1968; Бронштейн и Knull, 1981;. Ван и соавт, 1996, 1997). Альдолаз тетрамерный, и каждый мономер может связываться с F-актином (Wang и др., 1997). Между действием между MIC2 или TRAP CD с альдолазами является прямым, и включает в себя консервативный trypto-Phan внутри CD (Jewett и Сиб, 2003). Наличие дополнительных альдолазу контактирование остатков было описано в Plasmodium TRAP (Buscaglia и др., 2003). Вполне вероятно, что две несмежные кислотные участки в TRAP хвосте взаимодействуют с положительно заряженными районами, разбросанных по всей поверхности альдолазов. Конкретная ассоциация F-актин, альдолазы,
Т. гондий альдолаз отображает апикальной перекос локализацию в неподвижных паразитах, и под-идет частичное перераспределение в заднем во время перистальтики подобного тому, что наблюдается с MIC2 (Jewett и Сиб, 2003). Нет доказательств секреции альдолазы не было видно, что подтверждает, что он функционирует в паразита. Эти результаты могут отражать ассоциацию альдолазов с компакт-диском из MIC2, который простирается от micronemes в цитозоль. Это было подтверждено ультраструктурными исследованиями в слюнной железе Plasmodium спорозоитов, показывающих, что альдолазы локализуются на периферию секреторных micronemes, содержащих TRAP (Buscaglia и др., 2003). Таким образом, взаимодействие между альдолазами и MIC2 или TRAP хвостом, вероятно, происходит во время или предшествующего биогенеза из micronemes. При контакте с клетками мишеней, паразит выпускает содержимое micronemes в переднем полюсе паразита; MIC2 содержащих micronemes могут сливаться с мембраной паразита (Каррузерс
| MICRONEMES |
и Сиб, 1999), в результате чего адгезионные доменов MIC2 к поверхности паразита и aldolase- актина комплексу под мембрану паразита плазмы. Таким образом, альдолазы обеспечивают связь между адгезинами зацепления с рецепторами клеток-хозяина и актинового цитоскелетом, на котором миозин может ходить, толкая Mic2 / альдолаз комплекс по направлению к заднему концу паразита. Посредники полимеризации актина в apicomplexan паразитов неизвестны. Нет гомологи к любому из белков, которые образуют F-актин нуклеирующего комплекс Arp2 / 3 выявлены не были.
миозин Роль для миозина в инвазии и Мотыль-Ity первоначально была предложена исследованиями с использованием бутана-дион моноксимы (BDM), ингибитор миозина АТФазы (Добровольски и др., 1997a). Впоследствии, функциональная роль миозина была подтверждена Condi-ционных разрушения гена Т. гондий MyoA (Meissner и др., 2002b). Истощение MyoA полностью Abro-ворота планирующего моторики этих паразитов, а также ухудшает как вторжение хост-клеток и выход, в то время как не наблюдается никакого эффекта на внутриклеточную репликацию и секрецию micronemal белков. Члены миозина надсемейства являются мехи-noenzymes, которые преобразуют химическую энергию, запасенную в АТФ в силу, направленной вдоль актиновых филаментов (Spudich, 1994). Миозина молекулы являются модульными двигателями, состоящими из трех доменов: N-концевой домен является актин-связывающего двигателем, средней шея связывает домен легкой цепи миозина, и расходящийся домен хвоста Считается, что цель данного миозина к месту его действий и, таким образом, отражает конкретную задачу двигателя. Тока репертуар миозинов в T.gondii, состоит из четырех генов, приводящих к пяти различным белкам (MyoA-E), и все XIV класса, который ограничен в Apicomplexa (Hettmann и др., 2000;. Delbac и др 2001; Heintzelman и Шварцман, 2001). С молекулярной массой в диапазоне от 90 до 125 кДа, эти миозины наименьшие молекулярные моторы, идентифицированные до сих пор. При использовании обратного генетического подхода и генерировании хвоста специфических антител, Hettman и его коллеги показали, что MyoA распределяется под плазматической мембраной тахизоитов (Hettmann и др., 2000). В то время как грецкий и MyoE не выражены в тахизоитах, MyoC Тока репертуар миозинов в T.gondii, состоит из четырех генов, приводящих к пяти различным белкам (MyoA-E), и все XIV класса, который ограничен в Apicomplexa (Hettmann и др., 2000;. Delbac и др 2001; Heintzelman и Шварцман, 2001). С молекулярной массой в диапазоне от 90 до 125 кДа, эти миозины наименьшие молекулярные моторы, идентифицированные до сих пор. При использовании обратного генетического подхода и генерировании хвоста специфических антител, Hettman и его коллеги показали, что MyoA распределяется под плазматической мембраной тахизоитов (Hettmann и др., 2000). В то время как грецкий и MyoE не выражены в тахизоитах, MyoC Тока репертуар миозинов в T.gondii, состоит из четырех генов, приводящих к пяти различным белкам (MyoA-E), и все XIV класса, который ограничен в Apicomplexa (Hettmann и др., 2000;. Delbac и др 2001; Heintzelman и Шварцман, 2001). С молекулярной массой в диапазоне от 90 до 125 кДа, эти миозины наименьшие молекулярные моторы, идентифицированные до сих пор. При использовании обратного генетического подхода и генерировании хвоста специфических антител, Hettman и его коллеги показали, что MyoA распределяется под плазматической мембраной тахизоитов (Hettmann и др., 2000). В то время как грецкий и MyoE не выражены в тахизоитах, MyoC Heintzelman и Шварцман, 2001). С молекулярной массой в диапазоне от 90 до 125 кДа, эти миозины наименьшие молекулярные моторы, идентифицированные до сих пор. При использовании обратного генетического подхода и генерировании хвоста специфических антител, Hettman и его коллеги показали, что MyoA распределяется под плазматической мембраной тахизоитов (Hettmann и др., 2000). В то время как грецкий и MyoE не выражены в тахизоитах, MyoC Heintzelman и Шварцман, 2001). С молекулярной массой в диапазоне от 90 до 125 кДа, эти миозины наименьшие молекулярные моторы, идентифицированные до сих пор. При использовании обратного генетического подхода и генерировании хвоста специфических антител, Hettman и его коллеги показали, что MyoA распределяется под плазматической мембраной тахизоитов (Hettmann и др., 2000). В то время как грецкий и MyoE не выражены в тахизоитах, MyoC
по-видимому, играет роль в делении паразита (Delbac и др., 2001). MyoD появляется обогащенный Периф-Eral области паразита, но это не так резко, как определено для MyoA (Delbac и др., 2001).
Уникальная локализация MyoA под плазматической мембраной помещает его в идеальном положении, чтобы передавать механическую энергию для движения вперед и инвазии клеток (Hettmann и др., 2000). Закрыть гомологи MyoA присутствуют в геномах Plasmodium SPP. (Heintzelman и Шварцман, 1997;. Пиндер и др., 1998; Hettmann и др., 2000; Matuschewski и др 2001), Babesia, Cryptosporidium и Theileria. Актин и миозин доля очень похожая картина под плазматической мембраной. В соответствии с этим наблюдением,
T. гондий MyoA связывается с F-актина в АТФ-зависимым образом в пробирке (Добровольски и др, 1997a;.. Hettmann и др, 2000; Негт-Гоц и др., 2002). Несмотря на некоторые необычные черты, MyoA выполняет биохимические требования для быстрого
двигатель с размером шага 5,3 нм и скоростью 5,2 ìм / с в направлении плюс конца актиновых филаментов,
и теоретически будет управлять скользя моторику со скоростью 3-5 ìм / с, который находится в диапазоне от наблюдаемой скорости Т. гондий тахизоитов (Хермы-Гоец и др., 2002). Направленность MyoA означает, что актиновые филаменты ориентированы их плюс концы к заднему полюсу.
Пара основных остатков в хвосте Т. гондий MyoA имеет важное значение для целевого его периферии, и эта локализация не зависит от актинового цитоскелета (Hettmann и др., 2000), но, вероятно, из-за специфическое и насыщаемым взаимодействие с компонент внутренней мембраны комплекса. MyoA ассоциируется с легкой цепью, MLC1, и двух других белков, GAP45 и GAP50, причем последний составной белок, который прикрепляет комплекс в мембране ИМК (Гаскинс и др., 2004). Иммунофлуоресценции анализ трансгенных пара-сайтов показал, что комплекс собран в несколько этапов при делении клеток в Т. гондий (Гаскинс и др., 2004). GAP50 находится во внутренней мембране комплексе как зрелых паразитов и незрелых дочерей; в отличие от этого, MyoA, MLC1,
286 Toxoplasma Секреторные БЕЛКИ И ИХ РОЛИ В инвазии клеток и внутриклеточное ВЫЖИВАНИЕ
Все apicomplexan паразиты, для которых данные последовательностей доступны обладают весьма похожими ортологами GAP45 и GAP50, предполагая, что их функ-ция сохраняется на протяжении всей филы. Во время их синтеза, MyoA, MLC1 и GAP45 синтезируют на цитоплазматических рибосом и связаны друг с другом в комплекс, прото-glideosome. GAP50, с другой стороны, со-поступательно вставлен в паразита ER и транспортируется к внутренней мембраны комплекса, где, в зрелых паразитов, он ассоциируется с MyoA / GAP45 / MLC1 прото-glideosome с образованием функциональной, ассоциированных с мембранами glideosome.
Для того, чтобы власть эффективный задний укупорки ССД и приведения в движение паразита внутри клетки, glideosome должны быть иммобилизованы в плоскости мембраны. Это может быть Accom-plished путем прямого или косвенного взаимодействия glideosome со стабильными элементами цитоскелета Toxoplasma. Вымораживание перелом анализ внутреннего комплекса мембраны показал кандидат, которые могли бы выполнить эту функцию в виде выравниваний Intramembranous частиц, присутствующих в обеих мембранах и распределяется таким образом, предполагая, что они связаны как с подмембранным скелетом и микротрубочками (Morrissette и др., 1997; Porchet и Torpier, 1977).
11.4.4.2 Протеолитические расколы во время вторжения
MIC белки широко обработаны на поверхности пару-сайте. Эти события обработки после экзоцитоза, вероятно, регулируют адгезию, и разрешить разрушение ВПК комплексов клеевых и диссоциацию взаимодействия паразит-хозяин в конце процесса вторжения. Пост-экзоцитоза протеолиз достигается, по меньшей мере, трех различных мероприятий протеазы, протеазы известной как microneme белков протеазами 1, 2, и 3 (MPP1, MPP2 и MPP3) (Каррузерс и др., 2000;. Чжоу и соавт, 2004).
MPP2 обрежет от короткого расширения N-концевого выше по потоку от А-домена из MIC2, и отвечают за несколько расколов в M2AP в пределах его С-концевой домена (Zhou и др., 2004). На основании частичного ингибирования химостатина и PMSF, и почти полное ингибирование и все п ALLM, MPP2 было предсказано, чтобы быть химотрипсинподобный
серин-протеазы или калпаин-подобный цистеина протеазы. Глобальный субстрат репертуар MPP2 анализировали путем сравнения ESA белков из всех п-обработанных паразитов с ЕКА от необработанных паразитов (Zhou и др., 2004). Это предполагает, что по крайней мере два дополнительных МИК также обрабатываются MPP2. MPP2, вероятно, участвует в расщеплении N- и С-концом MIC4, как и предполагалось ранее (Брехт и др., 2001), а также в процессе-тов из SUB1. MPP2, скорее всего, апикальный поверхность RESI-вмятина протеаза, так как ее продукты расщепления видны только после microneme секреции и обработок заметно повышен путем обработки cytD, который блокирует укупорку МИКА по направлению к заднему концу паразита и искусственно улавливает поверхность МИК в то же окрестности, тем самым облегчая обработку перед выпуском в супернатант (Каррузерс и др., 2000; Чжоу и др., 2004). MPP2 расщепление MIC2 было показано, чтобы облегчить взаимодействие с рецепторами хозяев или кластеризации адгезивных ССД на поверхности паразита (Барраган и др., 2005). Действительно, MIC2 связывается с ICAM-1, и это требует связывания с созреванием MPP2, предположительно, подвергая А-домен для взаимодействия.
Наиболее С-концевой расщепление M2AP не блокируется всех п, что указывает на наличие отдельной протеолитической активности, MPP3 (Zhou и др., 2004). Хотя MPP2 и обработки MPP3 событий было предложено регулировать адгезивную активность (Каррутерсом и Blackman, 2005), эта гипотеза не была проверена. Интересно, что паразиты, лишенные SUB1 лишены MPP2 и MPP3 Activ-ITY, основанный на анализе ССД секретируемых SUB1 KO паразитов (Binder, Каррутерсом и Ким, unpub-неопубликованными). Если SUB1 непосредственно отвечает за MPP2 и / или MPP3 деятельности или косвенно Regu-покойным этих протеаз активно исследуются.
Пост-экзоцитоза С-концевой расщепление MIC2, MIC6, MIC8, MIC12 и AMA1 был демон-strated (Каррузерс и др., 2000; Донахью и др., 2000; Reiss и др., 2001; Meissner и др., 2002a;. Опитц и др, 2002). Это событие в MIC2 представляет собой существенный шаг во время вторжения хост-клеток, так как мутации на основе нарушение MIC2 С-концевого протеолиза ухудшает запись хост-клеток (Brossier и др., 2003). Генетические и биохимические данные показывают, что С-концевой расщепление происходит внутри трансмембранного
| MICRONEMES |
(ТМ) домен с помощью регулируемого внутримембранных PROTE-olysis (RIP) (Опитц и др., 2002;. Чжоу и др., 2004; Howell и др, 2005). Протеаза отвечает за RIP названа MPP1, но он не был unequiv-ocally определен. MPP1 активность блокируется ингибитором протеазы серина 3,4-dichloroisocoumarin (DIC) (Howell и др., 2005), которое также было установлено, ингибирует инвазию клеток-хозяина Т. гондий (совет и др., 1999).
Сайт расщепления ТМА сохраняются между трансмембранной МИК токсоплазмы и других Apicomplexa (Доусо и др., 2005). Эти сайты расщепления напоминают последовательность распознавания для RHom-Бойд-протеаз, чья активность также чувствительна к DIC (городского и Freeman, 2003). Ромбовидные являются многоходовые мембраны сериновых протеаз, которые расщепляют внутри ТМ их субстрата. Во-первые доказательства того, что паразит ромбовидный может расщеплять трансмембранные МИК пришли из исследования городских и Freeman (2003), показывая, что Ромбовидный-1 от дрозофилы и RHBDL2 от человека расщеплять химерные белки, содержащих домен ТМА MIC2, MIC6 или MIC12 (Urban и Freeman, 2003).
Ромбовидные как гены присутствуют в геноме всех apicomplexan паразитов в настоящее время секвенировано. Т. гондий содержит шесть ромбовидные генов (ROM1-6) (Dowse и Soldati, 2005). ROM2 и ROM3 в основном выражены в спорозоитах, что исключают их роль в MPP1 деятельности на всех этапах паразита (Brossier и др., 2005). MPP1 активность предсказано быть конститутивным на поверхности паразита (Опитц и др., 2002). ROM1 локализуется micronemes и ROM4 и ROM5 выражены в плазматической мембране (Brossier и др, 2005;.. Доус и др, 2005). ROM5 является лучшим кандидатом для MPP1 Activ-Ity. Действительно, ROM5 локализуется на заднем полюсе паразита, где расщепление ССД, как полагают, происходит, и может расщеплять трансмембранный домены ССД в пробирке (Brossier и др., 2005).