РГА не относится к серологическим реакциям(!!!), так как в ней не участвует иммунная сыворотка, т. е. антитела. В основе РГА лежит агглютинация, т. е. склеивание эритроцитов человека, животных и птиц под действием вируса. было установлено, что способность вызывать агглютинацию эритроцитов обладают не только вирусы гриппа, но и некоторые другие представители миксовирусов (вирусы парагриппа, паротита, болезни Ньюкасла и др.), аденовирусы, вирусы оспы, некоторые нейротропные вирусы и другие. РГА используется для индикации (обнаружения) вирусов при проведении ориентировочной диагностики, для титрования вирусов по гемагглютинирующим свойствам (установление гемаг- глютинирующих единиц - АЕ). С помощью РГА нельзя иипировать и идентифицировать вирусы, т. к. в ней не участвует сыворотка (антитело). Гемагглютинацией обладают не все вирусы. Миксовирусы агглютинируют эритроциты многих видов животных, кур и человека. При постановке РГА нужно знать, какие эритроциты данным вирусом агглютинируются.
Основу феномена агглютинации, вызываемого вирусами, составляет адсорбция вирусов на поверхности эритроцитов, сопровождающаяся склеиванием (агглютинацией) последних и выпадением в осадок. Механизм РГА заключается в следующем: на поверхности эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, способные адсорбировать до 10.000 вирионов, а на поверхности гемагглютинирующих вирусов располагаются гемагглютинины - сложные белковые тела с энзиматической активностью. При смешивании эритроцитов с вируссодержащей жидкостью гемагглютинины вируса при помощи фермента муциназы вступают во взаимодействие с рецепторами эритроцитов, в результате чего происходит адсорбция вирусов на эритроцитах. Вирионы, адсорбированные на одном эритроците, способны свободными поверхностями соединяться с другими эритроцитами, образуя при этом мостики между ними, ч го и приводит к склеиванию (агглютинации) эритроцитов.
Адсорбция вирусов на эритроцитах является энзиматическим процессом. Через некоторое время после проявления гемагглютинации связь между вирусами и эритроцитами нарушается, так как вирусная муциназа разрушает рецепторы эритроцитов и вирусы элюируют (отсоединяются) с эритроцитов. Это надо иметь в виду при учете реакции. После элюции вируса эритроциты оседают на дно пробирки в виде бугорка (холмика, пуговки). Использованные в РГА эритроциты вторично этим же вирусом не агглютинируются, т. к. чувствительные к данному вирусу рецепторы у эритроцитов уже разрушены, но могут быть агглютинированы другими вирусами, к которым сохранились рецепторы.
В качестве антигена для РГА берут любой материал (патматериал в виде суспензии из органов, смывы, материал из зараженных куриных эмбрионов, культур ткани и др.), в котором предполагается наличие вируса. Материал должен быть жидким, без крупных частичек.
Эритроциты применяют в виде 1% взвеси в физиологическом растворе. Они могут быть свежеприготовленные или консервированные.
Физиологический раствор для постановки реакции используют с рН 7,0 - 7,4.
Для постановки ориентировочной РГА на чистое и хорошо обезжиренное предметное стекло наносят одну каплю вируссодержащего материала, к ней добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов и перемешивают стеклянной палочкой. В положительных случаях через несколько минут произойдет агглютинация эритроцитов в виде образования хлопьев.
При постановке реакции пробирочным способом используют серологические пробирки или панели (пластины из стекла или оргстекла) с лунками. В этом случае предварительно готовят двукратные разведения вируссодержащего материала, начиная с 1:10 (и далее двукратные разведения: 1:20, 1:40, 1:80 и т.д.) и до 1:1280 (иногда и более высокие). К каждому из разведений вируссодержащего материала, взятых в объеме по 0,5 мл, затем добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов и пробирки после встряхивания оставляют в покое на 30-60 минут при комнатной температуре, а затем учитывают результаты. Оценивают реакцию в крестах (плюсах).
При оценке реакции в крестах обращают внимание на характер осадка. Если эритроциты осели тонким слоем равномерно по дну пробирки (в виде зонтика), реакцию оценивают в четыре креста (++++). При оседании эритроцитов в виде зонтика, но с наличием менее равномерного распределения его по дну - три креста (+++). Если эритроциты осели в виде зонтика, но с волнистыми краями и в центре дна имеется более толстый слой из осадка неагглютинированных эритроцитов, реакцию считают в два креста (++). Значительное оседание эритроцитов плотным диском в центре пробиркой с зернистой каймой по краям (при наклоне пробирки эритроциты сползают) оцениваются в один крест (+). Если же эритроциты оседают на дно пробирки в виде холмика (бугорка) с ровными краями, при наклоне пробирки сползают такую реакцию считают отрицательной (-).
Титром вируса считается то наибольшее разведение его, которое способно давать реакцию гемагглютинации не менее чем в два (++) креста. Такое разведение содержит одну гемагглютинирующую единицу (1 АЕ).
Практика: 2 компонента: аг, однопроцентные эритроциты. (только гемагглютинирующий вирус)
Цель постановки:
-определить является ли вирус гемагглютинирующим
-определить титр вируса
Механизмы реакции:
У эритроцитов имеются рецепторы мукопротеидной природы, а у вирусов – фермент муциназа, и при их соединении одна вирусная частица может соединиться с несколькими эритроцитами, за счет чего на стекле образуются хлопья, а в лунках – зонтики. Реакция непродолжительная, через некоторое время муциназа вирусов разрушает рецепторы эритроцитов, и они оседают на дне в виде пуговки.
Реакцию можно поставить в 2х вариантах:
1. является ли вирус гемагглютинирующим.
Берут каплю эритроцитов и каплю вируса вносят на предметное стекло. В положительном случае (если вирус гемагглютинирующий) – хлопья, если отрицательный случай, то жидкость равномерно окрашивается в красный цвет.
2. используют планшеты\планшетки (такая форма с лунками, усеченными пробирками)
Вносят 0,2 мл физ. Раствора во все, и в первую 0,2 мл вируса. Перемешивают в первой лунке, потом переносят вирус во 2,3,4 и тд. Делают ряд последовательный двухкратных разведений.
Разведение по лункам: 1- 1:2; 2- 1:4; 3- 1:8, 4- 1:16 и тд.
Затем в каждую лунку вносят по 0,2 мл 1%-ых эритроцитов.
Контакт 20-30 минут
Учет
Планшетку под углом 45 градусов – эритроциты стекают в виде слезки (мало вируса).
Параллельно ставят контроь (0,2 мл физ р-ра, 0,2 эритроцитов) на самоагглютинацию эритроцитов