Среди новейших способов диагностики бактериальных и вирусных заболеваний особое место занимает люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия. Повышенная чувствительность, цветное изображение на темном нефлуоресцирующем фоне, возможность обнаружения телец-включений, некоторых крупных вирусов и риккетсий, простота и надежность - ценные качества этого вида микроскопии.
Особое значение люминесцентная микроскопия имеет при ускоренной диагностике инфекционных заболеваний, при ускоренной индикации возбудителя во внешней среде.
Результаты люминесцентной микроскопии являются довольно специфичными и высокоточными. По данным ряда авторов этот метод не уступает по показаниям данным биопробы и другим методам, однако для люминесцентной микроскопии нужно иметь высококачественные специфические флуоресцирующие сыворотки или иммуноглобулины. Люминесцентная микроскопия в последние годы находит все большее применение и является одним из главных методов при диагностике многих вирусных болезней.
В люминесцентной микроскопии используется явление фотолюминесценции, т. е. способность объекта светиться (издавать свечение) в момент облучения его ультрафиолетовыми лучами. Источниками таких лучей в люминесцентном микроскопе являются ргутно-кварцевые лампы. Для проведения микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, а также люминесцентные устройства, которые монтируются на обычный световой микроскоп, такие как ОИ-28 и другие. Результаты, получаемые при работе с люминесцентными устройствами, лишь незначительно уступают результатам, получаемым при работе со специальными люминесцентными микроскопами. Как микроскопы люминесцентные, так и устройства должны быть хорошо настроены, комнату для работы затемняют. Для иммерсионной микроскопии при люминесцентном исследовании используют специальное нефлуоресцирующее масло, заменители его (ди- метилфтолат ДЭТА) или просто дистиллированную воду при водной иммерсии. Настройку микроскопа или устройства проводят согласно прилагаемой к ним инструкции.
Объекты, рассматриваемые при люминесцентной микроскопии, могут давать собственную люминесценцию (аутолюминесценция), как, например, грибки микроспории, и такие объекты смотрят без всякой дополнительной окраски. Однако большинство патогенных микроорганизмов и вирусы аутолюминесценцией не обладают, а поэтому мазки надо обрабатывать либо специальными красками (флуорохромы), либо мечеными (флуоресцирующими) антителами. В связи с этим все методы обработки мазков для люминесцентной микроскопии можно разделить на две группы:
1. Метод флуорохромирования (МФ).
2. Методы флуоресцирующих антител (МФА) или иммунофлуо- ресценция (ИФ).
а) Метод флуорохромирования. По своей технике этот метод принципиально почти ничем не отличается от методов обычной окраски мазков, применяемых при световой обычной микроскопии. Для этих целей используют также анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски называются флуорохромами, а окраска ими - метод флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители как акридин оранжевый и желтый, аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуо- ресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Продается специальный набор - «Набор красителей для флуоресцентной микроскопии», содержащий 20 красителей. Растворяют флуорохромы в дистиллированной воде (или буфере), к некоторым из них добавляют фенол до 5%. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000 (акридин желтый 1:500, акридин оранжевый, родамин и корифосфин 1:10.000). Наибольший интерес здесь представляет акридин оранжевый, который окрашивает ДНК в ярко светящийся желто-зеленый цвет, а РНК в оранжево-красный. Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах. Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточное или вирусное) препараты (мазки, мазки-отпечатки) обрабатывают 0,5%-ным раствором ДНК-азы или PIIK-азы в течение 5-10 минут. При этом свечение клеточных ДНК или РНК сразу же исчезает, а вирусные ДНК или РНК продолжают светиться еще 20-30 минут. Это служит доказательством специфичности вирусных нуклеиновых кислот.
Метод флуорохромирования широко применяется при диагностики бактериальных болезней и для этого имеются разработанные ВИЭВ рекомендации для окрашивания различных микробов и спор.
б) Методы флуоресцирующих антител (МФА), иммунофлуо- ресценция (ИФ). МФА (ИФ) основаны на принципе специфического взаимодействия антигена со специфическими антителами, но используют здесь антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатно-зеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген специфический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с данным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом. Следовательно, здесь свечение антигена происходит не за счет окрашивания его, а за счет связавшихся с антигеном специфических окрашенных антител. Таким образом, все МФА являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставятся они не в пробирках, а на предметном стекле (в мазках) и используются флуоресцирующие антитела. В настоящее время налажено производство флуоресцирующих иммунных сывороток и гамма-глобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструкции по применению с указанием титра антител. Растворяют их для использования по мере надобности согласно инструкции, хранят в холодильниках при +4° С. Некоторые флуоресцирующие сыворотки выпускают в жидком виде.
МФА находят широкое применение при диагностике многих вирусных болезней - бешенство, грипп, болезнь Аусеки, вирусный гепатит плотоядных и чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др.
Все методы флуоресцирующих антител можно разделить на 2 разновидности:
1. Прямой МФА (предложен Кунсом и Капланом, 1942, 1950 гг.).
2. Непрямые МФА:
а) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Уэллера и Кунса, 1954 г.);
б) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Гольдвассера-Шепарда, 1858 г.).
Прямой МФА. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности и поэтому более широко применяется в практической работе.
Сущность и техника прямого МФА заключатся в том, что на предметное стекло с фиксированным на нем м^шГ(или мазком-отпечатком) из вируссодержащего материала наносят небольшое количество (2-3 капли) специфической подозреваемому антигену (вирусу) флуоресцирующей иммунной сыворотки, или иммуноглобулина, в рабочем титре и выдерживают во влажной камере (в чашке Петри с кусочком ваты, смоченной водой) в термостате в течение 30-40 минут при 36-37° С, а затем промывают буферным солевым раствором и дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой в люминесцентном микроскопе. Если антиген и антитела специфичны, образуется комплекс «антиген + антитело», который не смывается при промывании мазка и при микроскопии препарата будет отчетливо видно яркое салатно-зеленое свечение антигена за счет адсорбированных на нем флуоресцирующих антител. Если же антитела были неспецифичны антигену, находящемуся в мазке, или антигена в мазке вообще не оыло (от здоровых животных), то свечения антигена не будет и поле зрения будет темным потому, что антитела не связались с фиксированным мазком и смылись при промывании мазка. Предметные стекла для МФА должны быть тонкие, чистые и хорошо обезжиренные. Мазки и мазки-отпечатки нужно готовить тонкие, высушивают мазки на воздухе и фиксируют химическим способом (ацетон, метиловый спирт, спирт + эфир), можно фиксировать пламенем. В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение при просмотре в ядрах или цитоплазме пораженных вирусом клетках в виде различных гранул и телец-включений, а если клетка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон.
К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом методе в лаборатории на каждое вирусное заболевание нужно иметь специфическую флуоресцирующую сыворотку или глобулины, а они пока еще сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.
Непрямые МФА называются так потому, что флуоресцирующие антитела адсорбируются не на сам вирусный антиген, а на посредника, в качестве которого может быть специфическое вирусному антигену неокрашенное антитело (при антивидовом методе) или комплемент (при антикомплементарном методе). Непрямые МФА связаны с обработкой мазка в два этапа: вначале наносят специфическую вирусному антигену нефлуоресцирующую сыворотку (при антикомплементарном методе и комплементе одновременно) и контактируют 30-40 минут во влажной камере при 37° С, затем промывают буфером и водой (или просто водой) и наносят флуоресцирующую сыворотку специфичную противовирусным неокрашенным антителам (при антивидовом методе) или комплементу (при антикомплементарном методе), опять контактируют 30-40 минут во влажной камере в условиях термостата, промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микроскопом.
Непрямой МФА с использованием антииилоной флуоресцирующей сыворотки» На фиксированный мазок или отпечаток наносят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) иммунную неокрашенную сыворотку или иммуноглобулин, и выдерживают во влажной камере или термостате при 37°С 30-40 минут, затем промывают буферным раствором и водой. Если в мазке имеется антиген специфичный антителам сыворотки, образуется комплекс «антиген + антитело» (Аг + Ат), который не смывается при промывании мазка, но и не светится в люминесцентном микроскопе. Поэтому мазок дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулином (антивидовую сыворотку или глобулин получают путем гипериммунизации кроликов или другие виды животных сывороткой или глобулинами того вида животных, на которых получают специфическую для вируса гипериммунную нефлуоресцирующую сыворотку и такую антивидовую сыворотку обрабатывают флуорохромом, обычно ФИТЦ). Антивидовую флуоресцирующую сыворотку наносят на мазок и выдерживают во влажной камере при 37° С 30-40 минут, затем промывают водой или буфером и водой, высушивают на воздухе и смотрят. Антитела из флуоресцирующей антивидовой сыворотки, если они специфичны глобулинам неокрашенной иммунной противовирусной сыворотки, адсорбируются на комплексе Аг + Ат и образуется новый комплекс «Аг (вируса) + Ат противовирусной неокрашенной сыворотки (они же являются Аг для антивидовой сыворотки) + Ат (флуоресцирующие) антивидовой сыворотки».
При просмотре под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплекс будет светиться ярко салатно-зеленым цветом за счет флуоресцирующих антител антивидовой сыворотки.
Если же в первом этапе обработки компоненты были неспецифичны или не было в мазке антигена, комплекс «Аг + Ат» не образуется и антивидовые флуоресцирующие антитела не свяжутся, при промывании мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.
Непрямой МФА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки. Этот метод по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставится реакция на предметном стекле и вместо гемолитической системы используют флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку. Получают антикомплементарную сыворотку путем гипериммунизации кроликов натив- ной свежей сывороткой морской свинки (комплемент) и у кролика образуются антикомплементарные антитела, которые будут специфичны белкам сыворотки крови морской свинки (комплементу) и в реакцию будут вступать только с сывороткой крови морской свинки, которая является комплементом в РСК. Такую антикомплементарную сыворотку обрабатывают флуорохромом ФИТЦ-ем и получается флуоресцирующая сыворотка.
На приготовленный и фиксированный мазок вначале наносят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) нефлуорес- цирующую иммунную сыворотку и комплемент в рабочих титрах, контактируют в термостате при 37° С во влажной камере 30-40 минут (проходит реакция в баксистеме), а затем промывают водой. В случае, если, как и в пробирочной РСК, антиген в мазке будет специфичен нанесенным антителам, образуется комплекс «Аг вируса + Ат», на который адсорбируется комплемент и весь этот комплекс «Аг вируса + Ат иммунной неокрашенной сыворотки + комплемент» не смоется, но свечения под люминесцентным микроскопом не будет. Чтобы обнаружить этот комплекс, на мазок дополнительно затем наносят антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и вновь контактируют во влажной камере термостата 30-40 минут, после чего промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микроскопом. Флуоресцирующие антитела из антикомплементарной сыворотки адсорбируются на комплексе и весь вновь образовавшийся комплекс «Аг вируса + Ат специфической неокрашенной противовирусной сыворотки + комплемент + антикомплементарное Ат» в результате будет ярко светиться салатно-зеленым цветом. Преимуществом данного метода является то, что при этом методе для диагностики на любое бактериальное или вирусное заболевание достаточно иметь в лаборатории лишь одну антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и наборы специфических гипериммунных неокрашенных сывороток.Начало формыНачало формы