В нашем отделе была проведена работа по нокаутированию гена PDGF-A в ЭС клетках мыши и получению на основе этих клеток химерной мыши.
PDGF-A- белок, фактор роста тромбоцитов. Существует три типа димеров PDGF: А А, АВ и ВВ, состоящих из двух полипептидных цепей - PDGF-A и PDGF-B, которые кодируются двумя различными генами. Эти гены являются гомологичными и кодируют длинную и короткую формы PDGF, получающиеся путем альтернативного сплайсинга. В свою очередь существует 3 вида рецепторов для PDGF, кк и кк, также состоящих из полипептидов -PDGFR и PDGFR, кодируемых разными генами. Митогенная активность PDGF реализуется при его взаимодействии с рецептором, при этом PDGFR-a может связываться как с А-, так и с В-цепью PDGF, а PDGFR - только с В-цепью. Основным местом синтеза PDGF являют ся тромбоциты, хотя в незначительных количествах они синтезируются в эндотелии, моноцитах и макрофагах, гладкой мускулатуре, фибробластах, цитотрофобластах плаценты, нейронах и в глии. В большинстве клеточных типов экспрессия PDGF происходит при функциональной или митогенной активации, хотя в мегакариоцитах и нейронах она, по-видимому, конститутивна. По некоторым данным, помимо митогенной активности, PDGF принимает участие в процессах дифференцировки, хемотаксиса, в регуляции синтеза компонентов межклеточного матрикса. Обнаружена экспрессия PDGF и рецепторов к этим ростовым факторам как на самых ранних, доимплантационных, стадиях эмбрионального развития, так и при дифференцировке мезенхимы и нервной ткани PDGF продуцируют также многие опухоли, такие, например, как глиобластомы, нейробластомы, меланомы и остеосаркомы.
Вектор замещения для таргетинга конструировали на основе гена PDGF-A, проклонированного из библиотеки генов линии мышей 129Sv.
На рис. представлены этапы конструирования и окончательная структура соответствующего вектора. Этот вектор включал в себя фрагмент, содержащий экзоны 3 и 4. В экзон 3 был вставлен ген пео, обеспечивающий устойчивость к антибиотику неомицину. В качестве промотора гена пео использовали промотор гена фосфоглицерокиназы. Для проведения негативной селекции против случайного встраивания в геном использовали кассету с геном субъединицы А дифтерийного токсина. В работе использовали линию ЭС клеток w9.5, выделенную из линии мышей 129SvJ. Для получения химерных мышей ЭС клетки инъецировали в полость 3,5-дневных бластоцист мышей линии C57BI/6. Далее бластоцисты переносили в рог матки мышей линии BALB/c в сроки псевдобеременности 2,5-3,5 дня. Трансфекцию ЭС клеток проводили методом электропробоя. После электропорации ЭС клеток и последующей селекции было получено около 400 G418 устойчивых клонов ЭС клеток мыши, из которых 130 были заморожены и использованы для выделения ДНК. Среди первых 5 клонов, проанализированных с помощью блотгибридизации, был обнаружен один клон с таргетированным геном PDGF-А.
Схема строения гена PDGF-A, вектора, использованного для таргетинга, и мутантного гена PDGF-A со встроенной в его 3-й экзон PGK-иео-кассетой. Г - Handlll-фраг-мент гена PDGF-A дикого типа, Д - Hindlll-фрагмент гена. DT-A - кассета с геном субъединицы А дифтерийного токсина. PGK-neo-кассета с геном неомицинфосфотрансферазы под промотором гена фосфоглицерокиназы. Зонд отмечен линией под А. Заштрихованными и нумерованными прямоугольниками изображены экзоны гена PDGF-A, а линиями между ними - нитроны. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Сайты рестрикции: З - Hindlll, А' - Kpnl, В - BamHI, Ж - EcoRl, Mr - Ncol
Следующим этапом работы было получение химерных мышей путем инъекции клеток клона 1. В бластоцисты мыши. В результате пересадки 13 бластоцист родилась одна химерная самка со смешанной пигментированной шерстью черного цвета и цвета агути, что свидетельствует о способности таргетированных ЭС клеток принимать участие в развитии волосяных фолликулов в эмбриогенезе.
У гомозиготных мышей с нокаутированным геном PDGF-A наблюдались патологии во многих тканях мезенхимного происхождения. При развитии легких эта мутация приводила к эмфиземе и невозможности формирования альвеол. Как и ожидалось, гомозиготные по мутантному гену мыши погибали либо на эмбриональных стадиях, либо фазу после рождения. Эта работа уже дала первую важную информацию о роли PDGF-А. Однако поскольку имеются данные о различном фенотипическом проявлении гомозиготных "нокаутированных" генов в различных линиях мышей, одним из возможных вариантом продолжения этой работы является получение линии мышей, гомозиготной по "нокаутированному" гену PDGF-А с целью более детального анализа функций этого гена.
Заключение
В последнее время все большее внимание исследователей направлено на возможность клонирования млекопитающих путем переноса ядер в энуклеированные ооциты. Преимущество этого метода заключается в том, что все клетки в потомстве, включая зародышевые, представлены генотипом ЭС клеток. ЭС клетки сельскохозяйственных животных могут служить источником тотипотентных ядер, которые могут быть использованы в качестве доноров для пересадки ядер с целью получения генетически идентичных трансгенных животных причем практически в неограниченном количестве. Широкие перспективы открываются в плане возможного использования эмбриональных стволовых и стволовых клеток для клеточной терапии различных тяжелых заболеваний человека, таких как, например, диабет, онкологические и нейродегенеративные заболевания. Необходимым для достижения этой цели условием является получение in vitro как можно более "гомогенных" клеточных культур. В связи с этим чрезвычайно важным является поиск факторов как белковой так и небелковой природы, способных регулировать процессы дифференцировки этих клеток в определенном направлении. Таким образом, комплексные исследования соматических клеток млекопитающих и человека, включая эмбриональные стволовые клетки, открывают широкие возможности как для продолжения исследований фундаментальных молекулярно-генетических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности этих клеток, так и для практической медицины XXI в.