Характеристика эмбриональных стволовых клеток мыши
Отсутствие экспериментальных подтверждений бессмертности ЭС клеток и сложность их культивирования послужили основанием для проведения исследований по выявлению и поддержанию плюрипотентных свойств, отличающих эмбриональные клетки от соматических клеток культуры тканей. В настоящей работе были использованы две линии ЭС клеток мыши D3 и R1, обе линии выделены из бластоцист линии мышей 129/Sv. Одним из основных критериев плюрипотентности ЭС клеток принято считать форму колоний. Однако этот показатель во многом носит условный характер. По форме колоний иногда трудно отличить истинно эмбриональные клетки от клеток, спонтанно трансформированных в эмбриональную карциному. При фидерном способе культивирование формируются монослойные колонии округлой или удлиненной формы, с четко выраженными краями по периферии. Дифференцировка ЭС клеток приводит к морфологической гетерогенности и появлению колоний с неровными краями и тенденцией к вертикальному росту. Исследования ультраструктуры ЭС клеток показали, что клетки имеют относительно крупное ядро, содержащее преимущественно эухроматин, одно или два ядрышка, в которых доминируют гранулярные компоненты. В отличие от общепринятых представлений о том, что ЭС клетки лишены большинства органелл, в их цитоплазме были обнаружены многочисленные свободные рибосомы, шероховатый эндоплазматический ретикулум представлен единичными цистернами, что свидетельствует о низком уровне синтетической активности, комплекс Гольджи, около которого располагались 1-2 центриоли, митохондрии и многочисленные лизосомы.
Ультраструктура ЭС клетки. Х5800. Видно крупное ядро клетки, а также эндоплазматический ретикулум и митохондрии
Аналогичная ультраструктура была выявлена в ранних мышиных зародышах на стадии бластоцисты. Клетки внутренней клеточной массы и ЭС клетки прошедшие, в культуре несколько пассажей, на ультраструктурном уровне имели большое сходство, что свидетельствует об общности их происхождения.
Были обнаружены небольшие межлинейные различия в пролиферативной активности и способности к дифференцировке, что, возможно, определялось генетической принадлежностью и возрастом ЭС клеток, т.е. количеством пассажей.
В популяции ЭС клеток преобладали клетки среднего размера. Они обладали адгезивными и пролиферативными свойствами, при контакте с фидером давали нормальные по внешнему виду монослойные колонии, а также были способны к дифференцировке в эмбриоидные тела. Более мелкие и более крупные, оставались не прикрепленными к субстрату и через некоторое время погибали или формировали колонии дифференцированных клеток. При этом морфологическая дифференцировка сопровождалась увеличением продолжительности стадии метафазы, а также частоты анеуплоидных и полиплоидных клеток и их гибели по механизму апоптоза.
Цитохимическое окрашивание ЭС клеток на выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы позволяет объективно оценить степень дифференцированное этих клеток. Окрашиваются колонии, сформированные недифференцированными эмбриональными клетками. Клетки фидера не дают положительной реакции на выявление активности щелочной фосфатазы.
Разные линии мышиных ЭС клеток гетерогенны по морфологии, требовательны к составу питательных сред, сыворотки и качеству фидера. Вопрос о том, какие из ЭС клеток являются плюрипотентными, т.е. способными нормально развиваться в составе целого зародыша, является важнейшим при решении задач биологии развития и эмбриотехнологии.
Трансформация ЭС клеток геном lif
Показано, что для поддержания ЭС клеток в плюрипотентном состоянии необходимо их культивирование на фидерном слое или в присутствии некоторых цитокинов, в частности LIF. В связи с этим были начаты исследования по изучению роли цитокина LIF в регуляции и поддержании плюрипотентных свойств ЭС клеток мыши in vitro. Эти исследования необходимы для выявления роли цитокина в процессах регуляции межклеточных взаимодействий и генетической стабильности.
Для проведения трансформации геном lif использовали плазмиду pcDNA3, несущую кодирующую последовательность гена lif мыши, и ген пео, обеспечивающий устойчивость к антибиотику G418. Трансформацию клеток R1 проводили с помощью метода электропорации. Трансформированные геном lif клоны были способны развиваться в культуре, при переносе их на подложку из желатины, с последующей селекцией на выживаемость в среде с высоким содержанием G418. Массовая гибель после трансформации наблюдалась на 3-й сутки культивирования. У трансформированных клеток R1 обнаруживается низкий уровень пролиферативной активности. В селективной среде с G418 клетки формируют небольшие плоские колонии без признаков морфологической дифференцировки в течение 10 дней. При окрашивании на выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы G418 резистентные клоны дают положительную реакцию. По морфологии колоний можно говорить о том, что сама процедура трансформации, по-видимому, не сопряжена с потерей плюрипотентности ЭС клеток.
Для детектирования уровня экспрессии гена lif, устойчивые к G418 клоны клеток линии R1 были проанализированы методом РТ-ПЦР, с использованием соответствующих праймеров. Было показано, что экспрессия гена обнаруживается в клонах с видимыми признаками морфологической дифференцировки. Возможно, что высокий уровень эндогенного LIF в трансфицированных клетках тормозит их пролиферативную активность и способствует переходу в дифференцированное состояние.
Необходимость применения фидерного слоя при культивировании ЭС клеток связано с продукцией LIF клетками первичных эмбриональных фибробластов, которые обеспечивают достаточный уровень концентрации этого фактора в непосредственной близости от ЭС клеток. Попытка стабилизировать плюрипотентные свойства ЭС клеток мыши линии R1 путем трансформации их геном подтверждает его участие в процессах раннего развития и дифференцировки.