Не менее красивыми были работы с белками-транспортерами (я в них участвовал только на ранних стадиях, поэтому имею полное право их хвалить, не становясь хвастуном). Транспортеры — золотое дно для биоинформатиков, поскольку опознать транспортер, в особенности бактериальный, достаточно легко. У них есть несколько гидрофобных спиралей, проходящих через мембрану: между ними находится канал, сквозь который ион или молекула, нужные для жизни клетки, проникают внутрь. Трансмембранные сегменты можно найти в белковой последовательности с помощью специальных программ. И если в неизвестном бактериальном белке пять или шесть таких сегментов, это почти наверняка транспортер (потому что другие трансмембранные белки, например участники дыхательной цепи или родопсин, хорошо известны). Остается установить, что за вещество он переносит.
Рис. 2. Вот так выглядели предсказанные in silico транспортные системы, несущие в клетку кобальт (Cbi) и никель (Nik). Слева — расположение белков в мембране (внутренняя сторона снизу), справа — расположение их генов в локусе. Одинаковыми буквами и цветом обозначены гомологичные белки: О (АТФаза) и Q (трансмембранный белок) — универсальные компоненты, в то время как CbiM, CbiN, NikN, NikL и NikK — дополнительные и могут различаться. Всех удивила догадка биоинформатиков, что базовый модуль CbiM—CbiN остается активным и без АТФазы (по рисунку Д. Родионова из статьи в «Journal of Bacteriology », 2006, т. 188, 1, с. 317–327). Изображение: «Химия и жизнь»
Изучать специфичность транспортеров в эксперименте — удовольствие ниже среднего. С ферментами гораздо проще, это практически рутинная задача, которую можно доверить роботу. Вы гиперэкспрессируете фермент (то есть заставляете синтезироваться в больших количествах), а потом предлагаете ему пять сотен разных субстратов и смотрите, с каким из них пойдет реакция.
Транспортер, конечно, тоже можно гиперэкспрессировать. Но чтобы он заработал, он должен сразу встроиться в мембрану, иначе гидрофобные сегменты «налипнут» друг на друга, белок образует нефункциональные агрегаты. Поэтому приходится делать множество мембранных пузырьков-везикул, встраивать в них белки в правильной ориентации, а потом смотреть, попадает ли искомое вещество внутрь везикул. Вдобавок транспортеры бывают разные. Одни закачивают в клетку полезные вещества против градиента концентрации и затрачивают на это энергию молекулы АТФ, которую расщепляет специальный белок — АТФаза. Другие осуществляют вторичный транспорт — впуская «нужную» молекулу, одновременно выпускают по градиенту концентрации ион водорода, калия или натрия. Если транспортер АТФ-зависимый, то, чтобы он заработал, необходимо собирать конструкцию из нескольких белков, в том числе АТФазы. А если это вторичный транспорт, то нужно еще угадать, концентрацию какого иона надо увеличить внутри шарика. Отсюда ясно, что биохимия транспортеров — наука для сильных духом и экспериментальных данных по ним мало.
С другой стороны, определять специфичность транспортеров биоинформационными методами существенно проще. Достаточно прибегнуть к уже знакомой логике: например, если синтез этого белка регулируется цинковым репрессором, это, скорее всего, и будет цинковый транспортер, а если его ген находится в одном локусе с генами катаболизма рибозы, он, очевидно, переносит внутрь клетки рибозу... Именно таким образом мы в свое время нашли рибофлавиновый транспортер: имеется белок с неизвестной функцией, у него шесть потенциальных трансмембранных сегментов, регулируется совместно с генами рибофлавинового пути — значит, это транспортер либо рибофлавина, либо его предшественника. Но поскольку в некоторых геномах присутствовали и этот транспортер, и рибофлавин-зависимые белки, но не было пути синтеза рибофлавина из предшественников, значит, это мог быть транспортер только рибофлавина.
Проверять экспериментально конкретное предсказание существенно проще, чем начинать с нуля. Я всегда объясняю студентам, что биоинформатик — существо совершенно беззащитное, наподобие того персонажа приключенческого романа, который знает, где лежит клад. Пока он молчит, все его берегут и за ним ухаживают, но, когда он проговорится, он уже не нужен. Как только биоинформатик сказал «этот белок обладает такой-то функцией» — исключительно от порядочности экспериментаторов зависит, возьмут ли они его в соавторы после того, как проверят это утверждение. А утверждения, как читатель уже убедился, предельно простые и конкретные, достаточно один раз произнести их вслух.
С таких же простых умозаключений начиналась история более сложная, но и более интересная. Мы изучали регуляцию пути биосинтеза биотина (биотин — витамин Н, или В7, кофактор многих важных ферментов). Биотиновый транспортер был в это время не известен. У нас по ходу работы обнаружился транспортный белок, который регулируется, а иногда и локализуется вместе с генами биотинового пути. Дальше все как с рибофлавином: нашлись организмы, где биотинового пути нет, но есть белки, которые зависят него как от кофактора, и есть тот самый потенциальный транспортер — следовательно, это транспортер биотина.
Как уже было сказано, транспортеры бывают АТФ-зависимые и осуществляющие вторичный транспорт. Биотиновый транспортер был одиноким, никакого гена АТФазы поблизости не просматривалось, а значит, это был вторичный транспортер. Но затем мы увидели, что в некоторых геномах рядом с биотиновым транспортером попадаются какие-то АТФазы. Что это означает, на том этапе было непонятно, и потому мы просто упомянули про это в статье одной фразой.
Примерно тогда же мы изучали регуляцию кобаламинового пути. Кобаламин, или витамин В12, —также кофактор важных ферментов, очень крупная молекула с метаболическим путем соответственной сложности. Для этой истории существенно, что в центре молекулы кобаламина есть ион кобальта, который приносят в клетку опять же транспортеры. Таких транспортеров мы нашли немало, опубликовали о них статью — и в скором времени получили письмо от Томаса Эйтингера из Института микробиологии Гумбольдтовского университета (Берлин). Он призывал нас обратить внимание на то, что любой кобальтовый транспортер также может транспортировать никель, и наоборот, потому что специфичность у них слабая. Мы ответили, что рассматриваем транспортеры с точки зрения их функциональной роли в клетке, и если ген белка находится в одном опероне с большим набором генов кобаламинового синтеза — безусловно, белок нужен клетке как транспортер кобальта, хотя in vitro его и можно заставить переносить никель. А если мы видим ген транспортера в одном опероне с никель-зависимой уреазой, то это, безусловно, никелевый транспортер.
Рис. 3. Есть обширная группа бактериальных транспортеров, которые содержат универсальный, общий для всех АТФазный компонент, поставляющий энергию для переноса (красный, ему соответствует CbiO на рис. 2), и общий трансмембранный белок (синий, CbiQ), а также дополнительный белок, который обеспечивает специфичность — определяет тип переносимого вещества (как CbiMN). Дополнительный компонент может работать и как независимый транспортер (по рисунку Д. Родионова). Изображение: «Химия и жизнь»
Намечались перспективы совместной работы, и Дмитрий Родионов, который делал эту работу, подал вместе с немецкими коллегами заявку на небольшой совместный грант и поехал на три месяца в Берлин. (Дмитрий закончил МИФИ, после чего занимался у нас геномикой; потом работал в США, а сейчас выиграл грант академической программы «Молекулярная и клеточная биология» на создание новой группы и возвращается в Москву.)
К этому времени мы с ними начали делать (по электронной почте) большой проект по сравнительной геномике транспортеров никеля и кобальта, где классифицировали их, во-первых, по регуляции, а во-вторых, по локализации, совместной с кобальтовыми или никелевыми функциональными белками. Так вот, в одном из этих никелево-кобальтовых семейств наблюдались некоторые странности. С одной стороны, АТФазы и трансмембранные белки, образующие канал для иона, как положено, располагались рядом и регулировались совместно. С другой стороны, в том же опероне мог находиться еще один трансмембранный белок. Причем эти «посторонние» белки в кобальтовых и никелевых транспортных системах отличались довольно сильно, не были гомологичными в отличие от АТФаз и трансмембранников. И вдобавок АТФаза и трансмембранный белок оказались гомологичными тем самым «лишним» биотиновым белкам, которые то попадались, то нет в предыдущем исследовании.
До сих пор не знаю, каким способом Дима уговорил немецких коллег на следующий безумный эксперимент. «Классическим» биохимикам, которые всю жизнь изучают транспорт кобальта и никеля у бактерий, он предложил: давайте у транспортера отключим АТФазу и трансмембранный белок, гомологичные биотиновым, оставим один только уникальный компонент. Ведь биотиновому транспортеру АТФаза и «основной» трансмембранник не очень нужны, они то есть, то их нет, — может быть, они и никелевому транспортеру не нужны, одинокий негомологичный трансмембранник и сам справится? Неизвестно, почему добропорядочные немецкие биохимики решились на это странное деяние: лишить вроде бы обычный АТФ-зависимый транспортер АТФазы и посмотреть, что будет. Так или иначе, Дима оказался прав. Одинокий трансмембранник работал как кобальтовый транспортер — менее эффективно, но работал. Это был первый пример двойной системы, которая, если есть АТФаза, работает какАТФ-зависимая, а если ее нет, работает как ион-зависимая.
Позднее берлинские коллеги то же самое сделали с биотином: взяли бактерию, у которой биотиновый транспортер имеет АТФазу и трансмембранник, отключили их гены — и показали, что этот белок в одиночестве тоже работает как биотиновый транспортер, хотя и с меньшей мощностью, чем в присутствии АТФазы.
Дмитрий Родионов в это время уже работал постдоком в лаборатории Андрея Остермана в Институте медицинских исследований Бэрнема в Ла-Хойе. Остерман — замечательный человек, биохимик, который понял эффективность биоинформатических методов, научился ими пользоваться и нашел с их помощью множество новых ферментов. И вот, когда Дмитрий попал в круг биохимиков и начал с ними общаться, оказалось, что подобных транспортеров, переносящих разные субстраты — кофакторы, аминокислоты, ионы, — существует несколько десятков. (Кстати, таким же оказался и рибофлавиновый транспортер.) Разные исследовательские группы независимо друг от друга изучали эти транспортеры, не имея представления о том, что они принадлежат к одному семейству.
Стало понятным и то, как возможна подобная организация. Кобальтовые и никелевые транспортеры отдельно от своей АТФазы не встречаются (если ее не убрать экспериментально). Но есть и другой класс бактериальных транспортеров, которые используют одну и ту же АТФазу — как отвертку со съемным жалом. Универсальные АТФаза и трансмембранный белок в этом случае могут кодироваться вместе с рибосомными белками, то есть экспрессируются постоянно и в больших количествах. А те белки, которые обеспечивают транспортерам специфичность, раскиданы там и сям в соответствующих оперонах. А в отсутствие АТФазы такой белок худо-бедно работает как вторичный транспортер, и поэтому в геномах некоторых организмов мы видим только его.