Актуальность исследования. Тревога является эволюционно выработанной адаптационной реакцией, реализующейся в мобилизации ресурсов организма в ситуации угрозы и изменяющихся условиях существования. Как пониженный, так и повышенный уровень тревожности, не адекватный среде обитания, снижает вероятность выживания особи в природе, снижает качество жизни человека. Патологически повышенный уровень тревоги, представленный в расстройствах тревожного спектра, является одним из наиболее распространенных клинических проявлений психических заболеваний.
В фармакотерапии тревожных расстройств чаще всего используются препараты, модулирующие состояние ГАМК-бензодиазепиновой и серотониновой систем. Доказано также, что в регуляции тревожности принимают участие норадренергическая, ацетилхолиновая, дофаминовая и глутаматергическая системы (Belzung, Le Pape, 1994, Tanaka et al., 2000, Salgado-Pineda et al., 2005, Alt et al., 2006).
В последние годы растет количество сообщений о роли регуляторных пептидов как в реализации проявлений тревоги, так и в подавлении их. Суммируя литературные данные, к «протревожным» можно отнести около двух десятков нейропептидов, включая эндозепины, кортиколиберин, холецистокинин, нейротензин, вазопрессин, ангиотензин и другие. К группе пептидов, выполняющих «противотревожные» функции в ЦНС относятся нейропептид Y, галанин, пролактин, окситоцин, соматостатин, обестатин, нейропептид S и ряд других регуляторных пептидов. Биологические механизмы регуляции тревожности пептидами связаны, как правило, с модуляцией активности указанных выше нейрохимических систем, что позволяет поддерживать уровень тревожности, адекватный сложившейся ситуации. Логично предположить, что на начальных стадиях отклонения тревоги у психически здоровых лиц от нормы, в случае развития тревожных расстройств при пограничных психических нарушениях терапевтически эффективной может быть коррекция соответствующих регуляторных систем.
|
|
Исследованию роли опиоидных пептидов, эндогенной опиоидной системы в патогенезе тревоги к моменту начала диссертационного исследования были посвящены лишь немногочисленные и противоречивые публикации (Ng et al., 1996, Tsuda et al., 1996). Вместе с тем, важнейшая роль этой системы в регуляции эмоций, в реализации развития психоэмоциональных и соматических проявлений стрессовых реакций не вызывает сомнений. Кроме того, опиоидная система функционально тесно связана с серотониновой (Oomagari, 1989, Agmo, Belzung 1998, Yilmaz et al., 1998), ГАМК-ергической (Stanford, Cooper, 1999, Shen, Johnson, 2002, Roberto, Siggins, 2006), холецистокининовой (Hebb et al., 2005) и другими нейрохимическими системами, роль которых в развитии тревоги доказана.
В настоящее время особое внимание уделяется разработке лечебных психотропных препаратов пептидной природы. Преимуществом пептидных препаратов является крайне низкая вероятность токсичности при введении даже в больших дозах, поскольку продуктами их деградации являются природные аминокислоты. Кроме того, регуляторные пептиды выполняют, в основном, гомеостатические функции, что существенно снижает вероятность развития отрицательных побочных эффектов при их использовании. Результатом многолетнего целенаправленного исследования по поиску и изучению нейротропного действия пептидов явилось создание оригинального пептидного соединения – селанка – (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) (Пономарёва-Степная и соавт., 1984). С использованием ряда поведенческих моделей в доклинических исследованиях были получены данные об эффективности селанка как анксиолитика, обладающего также ноотропным и стресс-протективным действием (Середенин и соавт., 1995, 1996, 1998). Вместе с тем, биологический механизм действия селанка до конца не изучен. Можно предположить, что один из механизмов анксиолитического эффекта селанка связан с его воздействием на эндогенную опиоидную систему. Изучение влияния селанка на опиоидную систему может быть интересно также с точки зрения уточнения показаний к его применению при лечении тревожных расстройств.
|
|
Целью настоящего исследования было выявление изменений в опиоидной системе при формировании тревожных состояний и изучение опиоидергических механизмов действия новых анксиолитиков.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
1. Экспериментальное исследование анксиолитических эффектов агонистов опиоидных рецепторов (ОР) дельта- и мю-типов.
2. Исследование параметров, характеризующих состояние опиоидной системы (константы связывания центральных ОР, активность эндогенных лигандов ОР и скорость ферментативной деградации лей-энкефалина в мозгу и крови), у животных с различными поведенческими проявлениями тревожности.
3. Определение параметров, характеризующих активность энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) в крови людей с различными конституционально-личностными характеристиками и у больных с разными формами тревожных расстройств.
|
|
5. Изучение влияния пептидного анксиолитика селанка и его отдельных пептидных фрагментов на активность ЭДФ in vitro.
6. Экспериментальное исследование роли опиоидной системы в механизмах поведенческих эффектов селанка: сопоставление выраженности этих эффектов с действием препарата на активность ЭДФ in vivo и изучение возможности блокирования анксиолитического действия селанка антагонистом ОР налоксоном.
7. Экспериментальное исследование способности синтетического аналога энкефалинов даларгина и селанка, параллельно с анксиолитическим действием, препятствовать развитию стресс-индуцированных соматических нарушений на уровне сердечнососудистой и иммунной систем.
8. Сопоставление клинических эффектов селанка и медазепама с изменением активности ЭДФ в крови больных генерализованным тревожным расстройством.
Научная новизна. Установлена принципиальная возможность и перспективность нового подхода к фармакотерапии тревожных расстройств, связанного с активацией опиоидной системы путем воздействия на ОР δ-типа и / или ингибирования ферментов деградации эндогенных опиоидных пептидов.
Впервые получены и опубликованы данные об анксиолитическом эффекте агониста δ-ОР даларгина.
Впервые обнаружено, что один их механизмов биологического действия нового пептидного анксиолитика селанка опосредован его влиянием на опиоидную систему.
Впервые продемонстрировано, что для животных с различным уровнем поведенческих проявлений тревоги характерны различия по ряду параметров функционального состояния опиоидной системы: характеристики связывания центральных ОР, концентрация и скорость гидролиза эндогенных лигандов ОР в мозге и крови.
Впервые продемонстрированы различия в состоянии опиоидной системы здоровых людей с различными конституциональными характеристиками и больных с разными формами тревожных расстройств. Эти данные позволяют понять один из механизмов конституционально обусловленной предрасположенности человека к заболеваниям, в патогенезе которых существенно нарушение опиоидной системы.
Практическая значимость. Разработана методика хроматографического разделения продуктов деградации равномерно меченного тритием лей-энкефалина, позволяющая одновременно оценивать активность всех групп ЭДФ в микроколичестве биологических жидкостей и тканей человека и животного. Методика информативна для диагностики пациентов с тревожно-фобическими расстройствами и другими заболеваниями, нуждающихся в коррекции эндогенной опиоидной системы. В результате проведенного исследования установлено, что при генерализованном тревожном расстройстве (ГТР) наблюдается изменение состояния опиоидной системы, которое в значительной степени нормализуется в процессе терапии селанком. Сопоставление этих данных с результатами клинической эффективности селанка и опиоидзависимым механизмом его действия свидетельствует о патогенетической обоснованности применения препарата при ГТР.
Поскольку опиоидная система участвует в регуляции широкого спектра функций организма, предполагается целесообразным расширение показаний к использованию селанка и даларгина в целях профилактики и терапии психических и соматических заболеваний, характеризующихся значимыми нарушениями состояния этой системы. Данные о кардиотропном эффекте селанка свидетельствуют о перспективности его использования при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы, сопровождающихся тревожными расстройствами. Практический интерес представляют также данные о нормализующем действии даларгина на иммунную систему животных в условиях хронического стресса, что дает основание рекомендовать использование этого препарата для иммунокоррекции при истощении опиоидной системы.
Внедрение результатов исследования. Результаты проведенных исследований внедрены в работу ГУ Научного центра психического здоровья РАМН, ГУ Научно-исследовательского института фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Российского государственного медицинского университета и ФГУ Национального научного центра наркологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Апробация диссертации. Результаты исследования доложены и обсуждены на: Constituent Congress International Society for Pathophysiology, (Moscow, 1991); First Baltic See Conference of Psychosomatics and Psychotherapy (Kiel, Germany, 1992); First World Congress on Stress (Bethesda, USA, 1994); Second Baltic Sea Conference on Psychosomatic Medicine (Goteborg, Sweden, 1995), Third Annual Symposium on AIDS, Drugs of Abuse and Neuroimmune Axis (San Diego, USA, 1995); 13 съезде психиатров России (Москва, 2000); International conference on cell surface aminopeptidases (Nagoya, Japan, 2000); 3 международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Суздаль, 2001);9 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); 5 Международном симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2002); 2 съезде Российского научного общества фармакологов (М., 2003); Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003); Сессии «Актуальные проблемы психоэндокринологии» Всероссийской научно-практической конференции памяти профессора А.И. Белкина» (Москва, 2004); 8th Eur. Congress of Neuropharmacology. Russia (Moscow, 2005); 14‑ый сьезд психиатров России (Москва, 2005); 4 Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2006); 8th World Congress International Society for Adaptive Medicine (Moscow, 2006); Межлабораторном семинаре University of Pittsburgh (USA, 2006); Межлабораторном семинаре ГУ Научный центр психического здоровья РАМН, ГУ НИИ фармакологии им В.В. Закусова РАМН, Института биологии развития РАН, Института молекулярной генетики РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова,Московского НИИ психиатрии, Московского государственного медико-стоматологического университета и Российского государственного медицинского университета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Москва, 4 апреля 2007 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 64 печатные работы. Из них 34 статьи: 28 – в отечественных и 6 – в зарубежных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 862 источника (86 отечественных и 776 зарубежных). Диссертация изложена на 300 страницах, включает 33 таблицы и 25 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Фармакологическое воздействие на опиоидную систему путем введения агонистов ОР δ-типа и ингибиторов ферментов деградации опиоидных пептидов оказывает анксиолитическое действие, выраженность которого зависит от исходного состояния организма, определяемого как генотипическими факторами, так и воздействием окружающей среды.
2. Один из механизмов анксиолитического действия пептидного препарата селанка связан с активацией опиоидной системы, в частности, с ингибированием энкефалиндеградирующих ферментов.
3. Выраженный клинический эффект селанка наблюдается при генерализованном тревожном расстройстве, характеризующемся недостатком эндогенных ингибиторов ЭДФ, и сопровождается повышением среднего значения времени полупревращения лей-энкефалина в сыворотке крови больных.
4. Анксиолитическое действие селанка и даларгина на животных сопровождается коррекцией стресс-индуцированных соматических нарушений, в том числе, расстройств функций сердечно-сосудистой и иммунной систем.
Материалы и методы
Характеристика клинического материала. В работе всего изучено 225 человек. Из них 74 здоровых добровольца (39 женщин, 35 мужчин, средний возраст 30±2 года), 59 пациентов (29 женщин, 30 мужчин, средний возраст 31±2 года), у которых, в соответствии с критериями DSM‑4, диагносцировались тревожно-фобические расстройства (генерализованное тревожное расстройство, паническое расстройство или агорафобия)[1]. В рамках второй фазы клинических испытаний селанка было обследовано 30 больных, в состоянии которых имелись проявления тревоги. По МКБ‑10 у них было диагностировано ГТР (12 человек), смешанное тревожно-депрессивное расстройство и депрессивный эпизод (по 9 человек)[2]. В клинико-биологическое исследование, проводившееся в рамках третьей фазы клинических испытаний селанка в сравнении с медазепамом, были включены 62 пациента (13 мужч., 49 женщ., средний возраст 38,6±9,1 лет): 30 с генерализованным тревожным расстройством (F41.1) и 32 с неврастенией (F48.0). Продолжительность заболевания у всех пациентов равнялась 14,0±17,9 месяцев, у пациентов, страдающих ГТР и неврастенией – 12,0±10,0 и 15,9±23,0, соответственно[3]. Препарат селанк использовался в виде 0,15% раствора для интраназального применения, его суточная доза (2.7 мг) была разделена на 3 приема. Медазепам использовался в таблетированной лекарственной форме в суточной дозе 30 мг, разделенной на 3 приема.
Критериями, исключающими участие в исследовании как здоровых доноров, так обследованных больных, являлись: возраст старше 50 и моложе 18 лет, наличие в анамнезе острых и хронических заболеваний печени и почек, а также применение гипотензивных препаратов, фармакологическое действие которых основано на ингибировании ангиотензинпревращающего фермента (капотен, энап и т.п.).
Для оценки состояния пациентов использовались следующие методики: шкала оценки выраженности симптоматики,составленная на основе «Унифицированной системы оценки клинико-фармакологического действия психотропных препаратов у больных с пограничными нервно-психическими расстройствами» (Александровский и соавт., 1984), шкала для объективной оценки тревоги Гамильтона (HAMA) (Hamilton, 1959), шкала самооценки тревоги Цунга (ASRS, Zung, 1971), шкала общего клинического впечатления (CGI) (National Institute of Mental Health, 1976). Степень дисфункции вегетативной нервной системы оценивали по методу А.М. Вейна (1998 г.). Сила и интенсивность панических атак оценивалась по шкале панических атак и приступов тревоги Шихана (Sheehan, Sheehan, 1983).
Психологическое тестирование. Оценку конституционально-личностных характеристик пациентов проводили при помощи Личностного опросника Айзенка (Eysenck Personality Inventory, или EPI) в адаптации И.Н. Гильяшевой (1983), предназначенного для диагностики двух базовых измерений личности: невротизм – эмоциональная стабильность и экстраверсия-интроверсия. Сочетание оценок по этим шкалам позволяет разделить испытуемых на 4 типа темперамента: меланхоликов, холериков, сангвиников и флегматиков. Граничное условие – 12 баллов по обеим шкалам.
Уровень личностной тревожности пациентов определяли по шкале Спилбергера в адаптации Ю. Ханина (1976).
Используемые животные. В эксперименте использовали 574 белых беспородных крысы (517 самцов и 57 самок), 123 крысы-самца популяции Wistar, полученных из питомника РАМН «Столбовая», а также 270 мышей-самцов линии Balb/с, 68 мышей-самцов линии C57Black/6 и 10 белых беспородных крыс-самцов, полученных из питомника «Крюково-Центральное». Животных содержали в стандартных условиях вивария по 10 в клетке МАK IV при температуре 220С, световом режиме 12:12 часов (свет с 8.00 до 20.00), питьевом и пищевом режиме ad libitum. В течение 3 недель до начала эксперимента животные адаптировались к условиям вивария.
Тестирование спонтанной двигательной активности животных. Тестирование спонтанной двигательной активности крыс проводили в течение пяти минут в компьютеризированной системе Auto Track System (ATS) фирмы Columbus Instruments (США), представляющей собой «мягкий вариант» системы «открытое поле»: слабое освещение и размеры камеры (42х42х20 см) близки к обычным условиям содержания животных. Тестирование проводили в соответствии с методикой, разработанной под руководством проф. Г.Г. Барсегяна (Кордзадзе и соавт. 1992).
При проведении всех фармакологических исследований животных разбивали на экспериментальные группы, гомогенные по параметру «горизонтальная двигательная активность в ATS» (ГДА). При статистическом анализе полученных данных, в зависимости от величины выборки экспериментальных животных, было использовано два критерия ранжирования крыс по ГДА. В случае относительно маленьких выборок использованных в эксперименте животных, исходя из значений медианы ГДА, выделялось две группы: высоко- и низкоактивных. При достаточно больших выборках животных разбивали на три группы по методу, описанному Р.Н. Кордзадзе и соавторами (1992). Критериями отбора служили точки перегиба на кривой нормального распределения, описывающей ГДА данной выборки крыс. Крысы, значения ГДА которых располагались на кривой до первой точки перегиба, считались «низкоактивными», после второй точки перегиба – «высокоактивными», а животные с двигательной активностью, укладывающейся в среднюю часть кривой – «средними».
Тестирование двигательной активности большой выборки (около 2000) животных, проведенное в НЦ ПЗ РАМН в нашей лаборатории и в лаборатории проф. Г.Г. Барсегяна за несколько лет, показало, что для крыс популяции Wistar, полученных из питомника Столбовая, точки перегиба на кривой нормального распределения соответствовали ГДА около 1100 и 1600, а для белых беспородных крыс из питомника Крюково – 1086 и 1860 см/5 мин.
Спонтанную двигательную активность мышей оценивали в течение 5 мин в аналогичной ATS автоматизированной системе Rat-o-Matic (Columbus Instruments, США), регистрирующей горизонтальное перемещение (аналог ГДА), количество стоек и встряхиваний животного.
Обучение и тестирование крыс в «челночной камере». Обучение крыс в «челночной камере» проводили с использованием экспериментальной компьютеризированной установки «Reflex‑16» фирмы «Columbus Instr» (США) по схеме, описанной в статье А.А. Зозуля и соавт. (1996). К избравшим активную стратегию избегания относились животные, преимущественно (>70% предъявлений) реагировавшие на условный сигнал, животные с пассивной стратегией реагировали на электрошок или у них наблюдалось отсутствие перехода (>70% предъявлений).
В эксперименте по изучению влияния даларгина на иммунный статус и поведение крыс в «челночной камере» через день после окончания обучения животным проводили пятидневный курс введения даларгина. Даларгин вводили внутрибрюшинно по 20 мкг/кг один раз в день. Контрольным животным в том же объеме вводили физиологический раствор. На следующий день после последнего укола крыс тестировали в «челночных камерах» и через 2 часа после тестирования забивали.
Конфликтный тест Вогеля проводился в анксиометре фирмы «Columbus Instr» (США), как описано в статье А.А. Зозуля и соавт. (1999).
Тест «открытое поле» (ОП) проводили по стандартной методике (Середенин С.Б. и соавт., 1998).
Тестирование животных в установке «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) проводили по стандартной методике в течение 5 мин. Установка для тестирования крыс была приподнята на высоту 50 см и состояла из двух открытых (45х10 см), двух закрытых рукавов (45х10х40 см) с открытой крышей и центрального квадрата (в месте соединения) со стороной 10 см. Мышей тестировали в подобной установке с размерами рукавов 23х4.5 см и высотой стенок закрытого рукава 17.5 см.
При изучении анксиолитических эффектов опиоидных пептидов на крыс на следующий день после тестирования в АТS часть животных лишали питья при пищевом режиме ad libitum. Одновременно начинали курс введения (5 дней, 1 раз в день) даларгина или ДАГО (20 мкг/кг внутрибрюшинно в 0,2 мл физиологического раствора), крысам контрольной группы – физиологический раствор. Налоксон (10 мг/кг внутрибрюшинно) в соответствующем эксперименте вводили одновременно с даларгином. При исследовании центрального эффекта даларгина за день до инъекции крысам под легким эфирным наркозом и новокаиновой блокадой сверлили отверстие в крыше черепа и на сутки помещали в одиночные клетки при питьевом и пищевом режиме ad libitum. Препарат вводили однократно в четвертый желудочек мозга в дозах 0,05; 1,00 и 20,00 мкг/кг в 5 мкл. BNTX и налтрибен (0.5 и 10 мкг/кг) вводили одновременно с даларгином (0.05 мкг/кг).
Тестирование влияния селанка на поведение мышей Balb/c в ПКЛ проводили без дополнительных стрессорных воздействий через 30 минут после внутрибрюшинного введения в объеме 0.2 мл физиологического раствора, селанка (600 мкг/кг), налоксона (10 мг/кг) и смеси селанка с налоксоном в тех же дозах.
Определение частоты сердечных сокращений (ЧСС). Для измерения ЧСС животным подкожно вводили микроэлектроды в районе ушей, помещали в стандартную клетку при стандартном освещении и подключали к полиграфу «Мингограф‑7» (ФРГ). ЧСС определяли по количеству R-R интервалов за 10 сек с периодичностью в 30 секунд в течение 5 минут.
Пролиферативную активность лимфоцитов крови крыс определяли по включению Н-тимидина в ДНК культивируемых клеток. Для этого кровь разводили в 10 раз средой 199, содержащей 10 мМ ХЕПЕС и 50 мкг/мл гентамицина, 100 мкл разведенной крови смешивали со 100 мкл обогащенной среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамин неспецифический Т-клеточный митоген КонА (в диапазоне концентраций от 0 до 25 мкг/мл). Культивирование проводили при 37оС в течение 96 часов. За 20 часов до окончания инкубации в пробы добавляли по 2 мкКи Н-тимидина. Разделение включенного в ДНК и свободного 3Н-тимидина проводили фильтрацией на стекловолокнистых фильтрах GF/C с помощью клеточного харвестера. Радиоактивность определяли на счетчике MiniBeta.
Мембранную фракцию головного мозга крыс, используемую в радиорецепторном анализе (РРА), получали модифицированным методом Simantov et al. (1976). Для получения Р2 мембранной фракции, использованной при определении активности мембраносвязанных энкефалиндеградирующих ферментов, мозг животных гомогенизировали в охлажденном 50мМ Трис-НСI буфере рН 7,7, содержащем 20% сахарозы, (соотношение вес/объем =1/20) в гомогенизаторе Potter (стекло / тефлон). Гомогенат центрифугировали при 1000 g 20 мин, 4оС. Полученный супернатант повторно центрифугировали (30000g, 30 минут, 4оС), осадок ресуспендировали в том же объеме 50мМ Трис-НСI буфера рН 7,7 и снова осаждали (30000g, 30 минут, 4оС).
Вытесняющую активность лигандов ОР определяли в плазме крови и гиппокампе крыс. При взятии крови качестве антикоагулянта использовали 3% раствор Na2ЭДТА (в соотношении 1:10) с добавлением бацитрацин (200 мкг/мл крови). Кровь центрифугировали при 1000g 10 мин, 40С. Плазму замораживали и хранили при -400С. Гиппокампы выделяли на холоду, замораживали в жидком азоте и хранили при -400С.
Экстракцию опиоидов проводили 0,25 М уксусной кислотой (15 мин., 1000С, 1:10). Раствор замораживали, пробы лиофилизировали и хранили при -400С. Непосредственно перед тестированием образцы растворяли в 50 мМ трис-НСl буфере (рН 7.7), центрифугировали при 8000g 15 мин., в супернатантах определяли вытесняющую активность лигандов ОР мю- и дельта-типов радиорецепторным методом.
Радиорецепторный анализ проводили, как описано ранее (Зозуля А.А. и соавт., 1994).Инкубационная смесь объемом 300 мкл содержала 50мМ Трис-HCI буфер рH 7,7 (20оC)3Н-ДАДЛЭ (0,5–4,0 нМ, «Amersham», Великобритания, 42 Ки/ммоль) или 3Н-ДАГО (4,0 нМ, «Amersham», Великобритания, 40 Ки/ммоль), 1,0–1,5 мг/мл белка мембран головного мозга крыс, 50 мкг/мл ингибитора протеаз бацитрацина. Величину специфического связывания определяли по разности связывания меченого лиганда в отсутствии и присутствии избытка (2мкМ) соответствующих холодных лигандов. Она составляла в 65–85% от общей величины связывания. В случае определения вытесняющей активности эндогенных опиоидов в плазме крови и гиппокампе крыс в инкубационную среду добавляли экстракты этих тканей в трех разведениях, а параллельно строили калибровочные кривые вытеснения 3Н-ДАДЛЭ (4,0 нМ) и 3Н-ДАГО соответствующими холодными лигандами и лей-энкефалином. Активность эндогенных опиоидов в экстрактах оценивали сопоставлением полученных результатов с калибровочной кривой и выражали в моль-эквивалентах.
Равновесные константы связывания (константа диссоциации (Кд) и максимальное число мест связывания (Вмах)) Н-ДАДЛЭ с ОР обонятельных луковиц и стриатума крыс определяли путем линеаризации кривых насыщения в координатах Скэтчарда.
Определение активности энкефалиндеградирующих ферментов (ЭДФ) проводилось in vitro в плазме и сыворотке крови животных и человека и в мозге животных. В этих тканях гидролиз энкефалина происходит по всем пептидным связям и катализируется целым рядом ферментов. Для оценки суммарной активности ЭДФ в тканях определяли: при насыщающих концентрации субстрата максимальную скорость реакции (Vmax, по кривой Михаэлиса-Ментен), являющуюся суммой активностей всех ЭДФ, и при малых концентрациях субстрата – время полупревращения энкефалина (τ1/2), отражающее реальную скорость гидролиза этого пептида в биологических объектах.
При определении τ1/2 лей-энкефалина инкубационная смесь (конечный объем 50 мкл) содержала 10‑кратно разведенную плазму или сыворотку крови, 25 мМ трис-HCl (pH=7,5), 0,15М NaCl, 1 мкКи (150 нМ) равномерно меченного тритием [G3Н] – лей-энкефалина с удельной активностью 120 Ки/моль. Инкубацию проводили при температуре 37°С и останавливали добавлением 5 мкл 0,2 М НСl. Vmax определяли при добавлении 1.5 мМ холодного лей-энкефалина в инкубационную среду. При определении активности ЭДФ мозга инкубационная смесь содержала Р2‑мембранную фракцию мозга крысы или фракции гомогената мозга мышей в концентрации по белку 0.05 – 3.0 мг/мл. Продукты гидролиза [G3Н] – лей-энкефалина разделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в двух системах: этилацетат: изопропанол:вода: уксусная кислота 40:40:1:19 (для силикагельных пластинок Merck, Германия и SILICA GEL 6061, EASTMAN, Kodak Company, США) и 2‑бутанон: трет-бутанол: аммиак:вода 2:2,4:1:1 (для Silufol, Чехия).
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза [G3Н] – лей-энкефалина и [G3Н] – селанка. Для более четкого разделения всех возможных фрагментов [G3Н] – лей-энкефалина, образующихся в результате его ферментативного гидролиза, а также для анализа путей биодеградации селанка была использована ВЭЖХ по методу (Золотарев и соавт., 2006). Экстракцию пептидных фрагментов из биологических образцов проводили 4‑х кратным объемом ацетонитрила с дальнейшим переводом экстракта в 0.1% водный раствор трифторуксусной кислоты.
Методика определения содержания меченого пептида и его метаболитов основана на определении радиоактивности хроматографических пиков соответствующих немеченых фрагментов, предварительно введенных в исследуемый образец перед разделением и выделенных по данным УФ-детекции (спектрофотометр Beckman 165 (Altex) при одновременной детекции на длинах волн 254 и 280 нм). Хроматографию продуктов гидролиза [G3Н] – лей-энкефалина проводили на колонке «Kromasil С18» (4х150 мм) в смеси элюента А (5% ацетонитрил, содержащий 0.05% ТФУ и 0.05% гептафтормасляной кислоты) и элюента В (30% ацетонитрил в элюенте А). Использовали градиент В в А: от 0 до 10% (0–10 мин), от 10% до 50% за 12 мин, от 50% до 100% элюэнта В за 40 мин, – при скорости потока 1 мл/мин. Для хроматографии [G3Н] – селанка и его пептидных фрагментов использовали градиентное элюирование ацетонитрилом 15–35%, содержащим 0.1% гептафтормасляной кислоты, в течение 20 мин на той же колонке.
Концентрацию пептидов определяли по радиоактивности соответствующей фракции с учетом молярной радиоактивности данного фрагмента, которая была рассчитана по данным распределения тритиевой метки в исходном [G3H] – пептиде, полученным с помощью тритиевого ЯМР (Zolotarev et al., 2002).
Определение содержания белка в пробах проводили по методу M.M. Bradford (1976) с использованием наборов фирмы «Bio-Rad» (США). Для определения концентрации мембраносвязанного белка проводилась предварительная обработка мембран лизирующим буфером, содержащим 10 мМ Трис-НСl рН 7.4, 150 мМ NaCl, 1мМ ЭДТА, 0.1% додецилсульфат натрия, 1% Тритон Х‑100, 1% дезоксихолат натрия.
Общий кортизол в сыворотке крови определяли иммуно-ферментным методом с помощью наборов фирмы «DRG» (ФРГ).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «Statgraphics» и «Statistica» для Windows. Достоверность отличия результатов между группами оценивали с помощью критерия Стъюдента. Кроме того, были использованы методы корреляционного анализа для параметрических данных – по Пирсону (r), для непараметричеких – по Спирману (R).
Результаты и обсуждение