Изучение витамина B12 методом рентгеноструктурного анализа начала Дороти Ходжкин в Оксфорде в 1948 г., как только были получены первые кристаллы. Независимо подобную же работу проводил Уайт в Принстоне; позже обе группы исследователей объединили свои силы. Трудоемкие вычисления на основе результатов измерения отражении рентгеновских лучей позволили составить карты электронной плотности в трех измерениях. Постепенно, в несколько последовательных этапов, по мере того как определялось положение все большего числа атомов в структуре, расчеты уточнялись. Вся программа работы с витамином B 12 и теми его аналогами, которые были получены, потребовала примерно около 10 млн. вычислений. Для этого на последних этапах пришлось использовать электронные счетные машины. Никогда еще рентгеноструктурный анализ не применялся для изучения структуры столь сложной молекулы, и полный успех этой программы изучения явился замечательным достижением, несколько смутившим химиков-органиков и, кажется, удивившим даже самих специалистов по рентгеноструктурному анализу. Как заметила Дороти Ходжкин, "возможность записать химическую структуру главным образом на основании чисто кристаллографических данных о размещении атомов в пространстве – и притом для такой устрашающе сложной молекулы - это для всякого кристаллографа нечто похожее на мечту". Огромное преимущество этого метода состояло в том, что в отличие от химических методов он "работает" от центра к периферии. Иными словами, относительно тяжелый атом кобальта с наибольшей точностью указывал положение ближайших к нему атомов, а именно атомов макрокольца. Когда работа приближалась к завершению, оказалось, что единственными атомами, положение которых оставалось несколько сомнительным, были те, для которых оно было выяснено Фолкерсом и его сотрудниками в результате изучения продуктов окисления витамина. Вычисления, относившиеся к самому витамину B 12 , были на время отложены, когда исследователи смогли получить кристаллическую гексакарбоновую кислоту. Это более простое соединение неожиданно легко поддавалось рентгеноструктурному анализу, в связи с чем и были достигнуты большие успехи. К счастью, основные структурные особенности этого вещества и самого витамина оказались идентичными, так что исследования этих веществ взаимно дополняли друг друга. Однако они в обоих случаях независимо привели к весьма редкой структуре макрокольца. Макрокольцо содержит 4 восстановленных пиррольных кольца с прямой α-α-связьюю между кольцами А и D. Дальнейшие уточнения в расчётах сделались возможными в результате изучения двух кобаламинов, содержащих относительно тяжелые атомы, а именно производных тиоцианата и селеноцианата; позже для этой же цели был использован аналог витамина B 12 , содержавший два атома хлора на месте метильных групп у бензиминазола. Наконец, выяснилась природа боковых цепей, и можно было почти с полной уверенностью написать всю структурную формулу. Все оставшиеся сомнения были, по-видимому, разрешены дальнейшими вычислениями, позволившими даже установить, что в макрокольце 6 двойных связей.
Устойчивость
В литературе накопилось много данных об устойчивости витамина B 12 к действию как реактивов, так и лекарственных препаратов; многие из этих данных можно теперь истолковать, исходя из строения и реактивности различных частей молекулы витамина. Кристаллический цианкобаламин в твердом состоянии устойчив даже при действии температуры 100° в течение нескольких часов. По Березовскому, при нагревании кристаллического цианкобаламина при 100° происходит медленное разложение. В водных растворах он наиболее устойчив при рН от 4 до 6 (по Березовскому до 7); в этих пределах рН растворы можно стерилизовать автоклавированием при 120° с потерей лишь нескольких процентов активности. При pH 9 происходит быстрое разложение (примерно 90% в сутки). Аквокобаламин менее устойчив, особенно в щелочном растворе, но оба вещества инактивируются примерно на 90% в течение 1 часа при 100° при рН 8. Нагревание в сильно щелочном растворе использовали для количественного разрушения витамина B 12 с целью контроля при некоторых методах микробиологического определения активности. Однако в неочищенных препаратах некоторые восстанавливающие вещества могут оказывать защитное действие. Нейтральные или слегка кислые растворы витамина B 12 при комнатной температуре в темноте сохраняются годами, только в очень сильно разведенных растворах идет медленный гидролиз с образованием небольших количеств фактора В. В сильно кислых и, особенно в щелочных растворах при комнатной температуре происходит медленный гидролиз до карбоновых кислот. На свету цианид медленно отщепляется и образуется оксикобаламин, но при выдерживании раствора в темноте происходит обратный процесс. Длительное воздействие солнечного света ведет к необратимому разрушению. Характер действия восстановителей не всегда можно предсказать с уверенностью. Утверждают, что тиоловые соединения в низких концентрациях защищают витамин от разрушения, и их даже используют иногда с этой целью при микробиологических определениях, однако в больших количествах они сами могут вызвать разрушение витамина. Сульфит также рекомендовали применять для защиты Кобаламинов, особенно оксикобаламина. Аскорбиновая кислота действует не так, как другие, восстановители. Она довольно быстро разрушает витамин B 12b , но почти не действует на витамин B 12 . Данное наблюдение использовали при анализе смесей этих двух веществ, но такой метод пригоден лишь для сравнительно чистых растворов. В печеночных экстрактах содержится защитный фактор, которым оказалось железо; другие металлы, например медь, катализируют реакцию. В сухих лекарственных препаратах витамин B 12 устойчив при растирании в порошок с хлористым натрием или с маннитом. Растворы можно стабилизировать фенолом, подвергнутым двойной перегонке, хотя примеси, содержащиеся иногда в феноле, могут вызывать разрушение витамина. Совместное присутствие тиамина (витамина B 1 ) и никотинамида (или никотиновой кислоты) ведет к медленному разрушению витамина B 12 в растворе. Железо защищает витамин В 12 от взаимодействия с никотиновой кислотой
Механизм действия
Недостаток в пище витамина B 12 приводит к макроцитарной мегалобластической анемии. Нарушается работа нервной системы, наблюдается резкое снижение кислотности желудочного сока. Впрочем, авитаминоз В 12 может развиться даже при полноценном питании, т. к. для процесса всасывания витамина в тонкой кишке обязательно наличие в желудочном соке особого белка – гастромукопротеина (фактор Касла). В полном соответствии с буквальным переводом своего латинского названия, этот белок выделяется стенками желудка, теми же клетками, которые выделяют кислоту. Фактор Касла специфически связывает витамин В12. Точная роль этого фактора не выяснена. Полагают, что в составе комплекса с гастромукопротеином витамин всасывается в тонком кишечнике и поступает в кровь портальной системы в комплексе с транскобаламинами I и II, при этом фактор Касла гидролизуется. Когда биохимики привыкли к мысли, что витамин В 12 не просто специфический антипернициозный фактор, а один из витаминов группы В, они стали предполагать, что он подобно другим водорастворимым витаминам окажется кофактором по крайней мере в одной ферментной системе. Но вопреки ожиданию функции, приписываемые витамину B 12 различными исследователями, оказались столь многочисленными и разнообразными, что трудно было представить себе, как все они могли быть связаны с такой ролью кофактора. Поэтому стали искать его основную функцию. Например, казалось вероятным, что он каким-то образом ответствен за поддержание сульфгидрильных соединений в восстановленном реактивном состоянии; он мог бы, скажем, "активировать" различные SH-ферменты, препятствуя их окислению в неактивные S-S-формы. Или если он связан с синтезом белка, он был бы необходим для синтеза белковой части (апофермента) ряда ферментов. Позднейшие исследования, особенно с применением изотопов, поставили под сомнение некоторые из приписываемых витамину В 12 функций и выдвинули на первый план другие. Однако ряд новейших результатов еще не подтвержден.