В первом приближении, мягкий гидролиз разбавленной хлороводородной кислотой приводит к частичному дезаминированию, последовательному образованию моно-, ди-, три-, тетра-, пента-, гекса-, гептакарбоновых кислот с сохранением нуклеотида. Продолжительная обработка витамина B 12 холодной разведенной соляной кислотой приводила к медленной потере микробиологической активности, при этом интенсивность красной окраски не изменялась. Было обнаружено, что с увеличением длительности гидролиза возникает все более сложная смесь продуктов. Среди них одно-, двух-, трех- и четырехосновные кислоты, образующиеся при последовательном удалении аммиака из амидных групп. При добавлении азотистой кислоты в этих условиях образовывались также небольшие количества пяти- и шестиосновных кислот, обладающих красной окраской. Монокарбоновые кислоты можно разделить на три. Дикарбоновые кислоты также разделяются на три изомера; трикарбоновые кислоты фракционировать не удавалось. Этого и следовало ожидать при случайном гидролизе трех лабильных амидных групп. Относительные количества получаемых изомеров показывали, что одна из этих групп значительно лабильнее остальных. Три остальные амидные связи гидролизовались только при обработке кислотой в более жестких условиях или при каталитическом воздействии азотистой кислоты. Когда в результате рентгеноструктурного анализа строение витамина было выяснено, появилась возможность истолковать эти наблюдения. Три лабильные амидные группы, очевидно, принадлежат трем цепям пропионамида, а три стабильные группы - ацетамидным цепям. Это описание продуктов кислотного гидролиза упрощено, так как, за исключением случаев самого мягкого гидролиза, при электрофорезе выявлялась еще одна группа кислот. Эти кислоты образуются в результате отщепления не только ряда молекул аммиака, но также и нуклеотида. В водном растворе при мягком кислотном гидролизе (а также фотолитически или при каталитическом гидрировании) цианкобаламин, через промежуточную стадию В 12 r (см. Восстановление витамина В 12 ) с последующим окислением кислородом воздуха переходит в оксикобаламин.
|
|
Фактор В
Исследователи из лаборатории Глаксо нашли, что молекулу витамина можно аккуратно разделить на две части кратковременным нагреванием с концентрированной соляной кислотой или, еще лучше, с хлорной кислотой. При тщательно контролируемых условиях (например, 5 мин при 65°) амидные группы почти не подвергались гидролизу и главными продуктами были, нуклеотид и неизмененная остальная часть молекулы. Последний продукт сохранял микробиологическую активность и оказался идентичным природному фактору, выделенному из содержимого рубца жвачных. В присутствии цианида растворы этого вещества имели пурпурную окраску даже при слабо кислой реакции среды. Спектр поглощения был очень сходен со спектром дицианкобаламина, так что в этом состоянии вещество почти наверное содержало два остатка цианида, соединенных координационной связью с кобальтом. Однако в то время как дицианкобаламин имел кислотные свойства, новое соединение было нейтральным. Причина такого различия состояла в отщеплении кислого нуклеотидного остатка. Это наблюдение по существу явилось главным основанием для представления о витамине B 12 как внутренней соли.Ряд кислот, образующихся при гидролизе амидных групп в факторе В, обладал той же относительной стабильностью в их дициано-конфигурации.Были получены указания на то, что существует 7-я карбоксильная группа, связанная не с аммиаком, а через амин с нуклеотидом. Это подтверждало более раннее предположение о том, что аминопропиловый спирт служит мостиком между двумя частями молекулы, будучи соединенным амидной связью с одной из цепей пропионовой кислоты в планарной группе и эфирной связью - с фосфорной кислотой. В кислых растворах (с рН примерно менее 3) фактор В теряет обе группы цианида и ведет себя как основание. Соответствующие кислоты ведут себя сходным образом, так как карбоксильные группы не подвергаются заметной ионизации. Поэтому все вещества, не содержащие нуклеотида, можно отделить от веществ, еще сохранивших его.
|
|
Щелочной гидролиз
Жесткий щелочной гидролиз приводит к отщеплению 5,6-диметилбензимидазола и образованию дилактампента- и монолактамгексакарбоновых кислот. При обработке витамина B 12 перекисью водорода и разведенной щелочью на холоду и получаются микробиологически активные кислые продукты красного цвета. Реакция состоит в гидролизе, катализируемом перекисью водорода. Однако полученные кристаллические продукты, по-видимому, представляли собой смеси моно- и дикарбоновых кислот, образовавшихся в результате мягкого гидролиза, с неизмененным витамином B 12 , который обусловливал их биологическую активность. Под действием холодной разведенной щелочи, по-видимому, образуются те же продукты, что и при мягком кислотном гидролизе. Однако в присутствии горячей щелочи реакция идет по-иному. Если нагревать витамин B 12 в растворе NaOH в отсутствие кислорода, то окраска становится коричневой, а затем приобретает зеленоватый оттенок, это может указывать на уменьшение валентности атома кобальта, сопровождающееся окислением какой-то другой части молекулы. При доступе воздуха цвет снова становится красным. Кратковременное кипячение со щелочью при доступе воздуха дает в качестве главного продукта нейтральное кристаллизующееся красное вещество. Оно почти неотличимо от витамина B 12 по физическим свойствам, но не обладает микробиологической активностью. Структура этого соединения была выяснена главным образом путем рентгеноструктурного анализа кристаллов. Продукт, по-видимому, содержит лактамное кольцо, имеющее 2 общих атома с кольцом В и образующееся из ацетамидной цепи; остальная часть молекулы такая же, что и в самом витамине. Добавление тиогликолата натрия или цианида натрия к раствору витамина в основном защищает его от воздействия щелочи и кислорода. Полагают, что реакция протекает при участии свободных радикалов. Производное, содержащее лактам, было названо дегидровитамином B 12 . Лактамное кольцо чрезвычайно устойчиво и при дальнейшем воздействии щелочи сохраняется.
|
|
При гидролизе последовательно отщепляются остающиеся амидные группы и нуклеотид. Таким образом, получаются два ряда кислот – с нуклеотидом и без нуклеотида, - но все они отличаются от соответствующих продуктов кислотного гидролиза.
Конечным продуктом щелочного гидролиза является гексакарбоновая кислота, а не гептакарбоновая, как при кислотном гидролизе. Это связано с участием одной из потенциальных кислотных групп в построении лактамного кольца.
Основное значение этого кристаллического продукта распада состоит в использовании его для рентгеноструктурного анализа.
Продукты окисления
Исследование гидролиза дало ценные сведения о том, что можно было бы назвать периферией молекулы. Гораздо труднее оказалось изучить химическими методами структуру части молекулы, непосредственно окружающей атом кобальта. Кембриджская группа показала, что среди продуктов окисления витамина B 12 нельзя обнаружить амида малеиновой кислоты, так что вряд ли можно было относить витамин к истинным порфиринам. Но эти исследователи выделили в довольно большом количестве оксамовую кислоту.
Единственные азотсодержащие продукты расщепления "ядра" молекулы выделили в 1955 г. Фолкерс и сотр. Контролируемое окисление хроматом натрия в уксусной кислоте привело к образованию двух продуктов, изображенных на рисунке 6 (1 и 2). Полагали, что они образуются из группировки, имеющей пирролидиновую, пирролиновую или пирролениновую структуру (рис. 6, 3). Это были первые химические данные, указывающие на присутствие пирролоподобной структуры в молекуле, если не считать более ранних данных по пиролизу, позволявших предполагать такую структуру. Несколько позже был выделен и соответствующий продукт, содержащий амидную группу (амид кислоты, представленной на рис. 6, 2). Это явилось прямым химическим подтверждением местоположения, по крайней мере, одной из амидных групп.
При окислении цианкобаламина Н 2 О 2 в среде с рН меньше семи наблюдается выход продуктов, обладающих антагонистическим биологическим действием для lactobacillus leichmannii, в отличие от ростового для Euglena gracilis.
При окислении перманганатом калия отщепляется синильная кислота, а также образуются уксусная кислота, щавелевая кислота и ее амид, бутандиовая кислота, 2-метилбутандиовая и 2,2-диметилпропандиовая кислоты.
Восстановление витамина B 12
При каталитическом гидрировании на платиновом катализаторе цианкобаламин присоединяет пять атомов водорода и отщепляет метиламин, кобальт переходит в двухвалентное состояние с образованием т. н. В 12 r . При длительном восстановлении и при использовании более сильных восстановителей, таких как ацетат хрома при рН 9,5 или борогидрид натрия получают так называемый В 12 s , содержащий одновалентный кобальт. Восстановление внесло разочаровывающе малый вклад в наши знания о строении витамина, и даже теперь детальная структура продуктов восстановления еще достаточно не выяснена. Обработка водородом в качестве катализатора или некоторыми другими восстановительными агентами вызывает переход окраски в коричневую и, наконец, в серо-зеленую. Эти изменения, за исключением потери цианида, обратимы при контакте с кислородом воздуха, причем образуется витамин B 12а . Вопрос об изменениях валентности кобальта, происходящих при восстановлении. Работа Бивена и Джонсона, появившаяся после опубликования предположительной структуры витамина, пролила некоторый свет на не решенный еще вопрос о том, содержит он 5 или 6 сопряженных двойных связей.
Обратимое восстановление легко продемонстрировать, добавляя к щелочному раствору витамина B 12 тиогликолевую кислоту. Красная окраска медленно переходит в оранжево-бурую; после встряхивания раствора в присутствии воздуха она тотчас же вновь становится красной. По мере использования кислорода снова медленно появляется цвет восстановленного витамина B 12 .
Эти изменения окраски можно повторно вызывать почти до бесконечности: окончательный результат состоит в том, что витамин катализирует окисление тиогликолевой кислоты (по-видимому, до дисульфида) кислородом воздуха
Реакция с галогенами
Хлор обесцвечивает раствор цианкобаламина, другие галогены – нет. Продуктом хлорирования является фиолетовое кристаллическое вещество. Энергичное хлорирование витамина B 12 давало продукт, содержащий 30% хлора, природа его не была охарактеризована точнее. Петров и сотр. описали ряд продуктов, образующихся при обработке витамина хлором или хлорамином Т, которые можно было разделить методом хроматографии. Эти вещества имели пурпурный цвет, переходящий при избытке цианида в голубой, и содержали 2 атома хлора в молекуле. Воздействие одной молекулы хлорамина Т или брома дает в качестве главного продукта нейтральное кристаллизующееся вещество красного цвета. По физическим свойствам оно было очень сходно с витамином B 12 ,но не обладало микробиологической активностью. Электрофорез и инфракрасная спектроскопия доказали, что это был лактон; полагают, что его строение идентично строению лактама показанного на рис. 5, только вместо NH следует поставить О. Образование лактона, по-видимому, связано с промежуточным образованием иона карбония в активированном β-положении кольца В. Йод действует на витамин B 12 только в щелочных растворах, и при этом образуются как лактам, так и лактон, относительные количества которых зависят от концентрации щелочи и йода. Дальнейшая обработка хлорамином Т или бромом вела к образованию пурпурных веществ, которые становились голубыми при избытке цианида и содержали в молекуле соответственно хлор или бром. Эти продукты не были полностью охарактеризованы, но сходное вещество, возникавшее при действии хлорамина Т на лактам (дегидровитамин B 12 ), было изучено в Кембридже, и оказалось, что оно содержит только один атом хлора. Полагают, что хлор замещал водород при мезоуглеродном атоме между кольцами В и С. Эта работа в сочетании с другими данными помогла установить, что в молекуле витамина имеется 6 сопряженных двойных связей, а не 5, как предполагалось вначале
Метилирование
При действии избытка СН 3 - HgJ на J Cbl в спиртовом растворе при температуре 65 о С в течение трех часов можно получить метилкобаламин с выходом около 50%. Вообще реакциями корриноидов с сильными нуклеофилами получают соответствующие органокорриноиды. Между диметилсульфатом и самим витамином B 12 никакой реакции не происходит, так как атом азота участвует в координационной связи с кобальтом. Эта связь должна быть сначала разорвана путем превращения витамина B 12 в дицианкобаламин; даже и после этого реакция зависит от значения рН. Образующийся при этом четвертичный азот обусловливает возникновение добавочной основной группы в молекуле дицианида, которая в результате этого, обладает нейтральной реакцией (а не кислой, как молекула дицианкобаламина); эта структура устойчива в кислых растворах, так как метилирование препятствует образованию координационной связи между N3 и Со. Эта реакция была использована для изучения более сложных свойств аналога витамина B 12 – фактора III, который может быть метилирован или в любом из двух положений или в обоих одновременно.