Следующую группу Аденозилкобаламин-ферментов, составляют мутазы, катализирующие перегруппировки углеродного скелета и приводящие к обратимым превращениям субстратов с разветвленной цепью в соединения с прямой цепью.
Среди этих ферментов хорошо изучены два – глутаматмутаза и метилмалонил-СоА-мутаза.
Глутаматмутаза
Фермент, катализирующий превращение L -глутамата в L -трео-β-метиласпартат, был выделен, из Clostridium tetanomorphum. Показано, что многочисленные фотосинтезирующие микроорганизмы также содержат глутаматмутазу. Фермент, кроме аденозилкобаламина, нуждается в SH -соединении, однако, в отличие от диолдегидратаз и других аналогичных ферментов, для проявления каталитической активности не требуются одновалентные катионы. Фермент высокоспецифичен в отношении структуры субстратов. Ни аналоги глутаминовой кислоты, ни аналоги β-метиласпарагиновой кислоты (как, например, β-этиласпартат) не являются субстратами мутазы. Опыты по очистке фермента позволили установить субъединичную структуру и этого аденозилкобаламин-зависимого фермента. Были получены в гомогенном состоянии две субъединицы, которые были названы S - и Е-белками. Каждый из белков не обладал порознь активностью. Рекомбинация их и взаимодействие с коферментом приводили к восстановлению активности. Первым был очищен Е-белок. Определение молекулярного веса показало, что это довольно большой белок с мол. массой около 128 000. В отличие от ферментов, рассмотренных выше, добавление Кобаламина не защищало Е-компонент глутаматмутазы от инактивации в растворе. Е-компонент связывал 1 моль аденозилкобаламина, а в присутствии семикратного избытка S -компонента дополнительно связывал еще один моль кофермента. Компонент S после очистки, как оказалось, обладал намного меньшей мол. массой 17000 и, по-видимому, содержал важные для проявления ферментативной активности SH - группы. Титрование S -белка сульфгидрильными реагентами показало, что на 1 моль белка приходится пять SH -групп. Примечательной особенностью компонента была его способность к димеризации в присутствии О 2 . Расщепление димера осуществлялось обработкой последнего каким-либо RSH -соединением. Это свидетельствовало об образовании межмолекулярного дисульфидного мостика. Инактивация S -белка с помощью AsO 2 - доказывала наличие в активном центре по крайней мере одной из двух вицинальных тиольных групп.
Метилмалонил-СоА-мутаза
Другой аденозилкобаламин-зависимый фермент, осуществляющий перегруппировку углеродного скелета метилмалонил-СоА в сукцинил-СоА был также сначала выделен из микроорганизмов, а затем из тканей млекопитающих. Оказалось, что этот кобаламин-зависимый фермент выполняет метаболически важную роль на пути превращения пропионил-СоА в сукцинил-СоА. Схема этого участка метаболизма включает 3 фермента: биотин-зависимую карбоксилазу, рацемазу, превращающую D -метилмалонил-СоА в L-изомер и рассматриваемую кобаламин-мутазу. После очистки метилмалонил-СоА-мутазы оказалось, что это субъединичный фермент с мол. массой 124000, расщепляющийся на два компонента с мол. массой 61 000 и 63000. Выделенная из печени овцы метилмалонил-СоА-мутаза представляет собой окрашеный в оранжевый цвет белок с мол. массой 165000. Фермент связывал 1 моль аденозилкобаламин на 75000 2-метиленглутаратмутаза Следующий сходный по действию Аденозилкобаламин-зависимый фермент-это 2-метиленглутаратмутаза, катализирующая обратимое превращение между 2-метиленглутаратом и 2-метилен-З-метилсукцинатом. Фермент был выделен из микробиологических источников при выращивании Clostridium на средах, содержащих никотиновую кислоту. Определение молекулярной массы частично очищенного препарата дало величину 170000. Обработка йодацетатом приводит к потере активности, что, очевидно, свидетельствует о наличии важных для катализа SH-групп. Действие AsО 2 - , однако, не выявило присутствия вицинальных дитиольных групп.
Ферменты, трансформирующие α, ω-диаминокислоты
Еще одна группа аденозилкобаламин-зависимых ферментов была выявлена при исследовании микроорганизмов, растущих на L -лизине. Эти ферменты катализировали перенос NH 2 -гpyппы от концевого углеродного атома в диаминокислотах к соседнему атому углерода. Недавно описан аденозилкобаламин-зависимый фермент, который осуществляет перенос NH 2 -группы из α- в β-положение аминокислоты лейцина. Рассмотрим более подробно аденозилкобаламин-зависимые ферменты, трансформирующие α, ω-диаминокислоты. Эти ферменты выделены из различных штаммов Clostridium. Важно, что все три фермента в высшей степени специфичны для каждого из субстратов. Замена субстрата для данного фермента на субстраты других аминомутаз не позволяет осуществлять перенос аминогруппы. D-α-Лизинмутаза выделена из С. sticklandi, мол. масса 250000. В процессе очистки фермента не происходило отщепления аденозилкобаламина, что свидетельствует о большой прочности связи комплекса апофермент-кофермент. Аналогично от L-β-лизинмутазы в процессе очистки аденозилкобаламин также не отделялся. Это тетрамерный фермент с мол. массой 160000; его субъединичная структура была подтверждена после того, как удалось выделить компоненты с мол. массой 32000 и 52000. Оказалось, что для обеспечения нормальной каталитической активности обеих мутаз необходим белок с мол. массой 60000. Как видно, аминомутазы сохраняют способность защищать в полностью реконструированном виде важные для биокатализа SH-группы. Это свойство характерно для большинства Аденозилкобаламин-ферментов. Орнитинмутаза также представляет собой фермент с прочно связанным аденозилкобаламином, который не отщепляется при очистке. Очищенный фермент имел мол. массу 170 000 и диссоциировал на две субъединицы с мол. массой 90000. Этот фермент не требовал для своей активации какого-либо SH-белка, однако сам содержал важные для биокатализа SH-группы, вследствие чего ингибировался под действием тиоловых ингибиторов. Заслуживает особого внимания прочность, с которой связан аденозилкобаламин во всех трех ферментах. При обработке их внутренним фактором ферменты инактивировались. Сравнительное исследование трех аминомутаз показало, что в дополнение к аденозилкобаламину для проявления их активности требуются: для D-α- и L-β-мутаз ионы Mg 2+ и одновалентные катионы, причем для D-α-лизинмутазы-это К + , Rb + и NH 4 + (фермент ингибируется при добавлении Na + и Li + ). L-β-лизин-мутаза в разной степени активна в присутствии Li + , Na + , К + , Rb + , Cs + и. NH 4 + . Для проявления активности орнитинмутазы добавления ионов металлов вообще не требуется. Поразительное отличие аминомутаз от всех остальных кобаламин-зависимых ферментов состоит в том, что вторым обязательным коферментом для них является пиридоксальфосфат, который обеспечивает перенос ω-NH 4 -гpyппы в форме пиридоксамина или пиридоксальдимина. Очищенная орнитинмутаза неактивна до тех пор, пока к реакционной смеси не будет добавлен пиридоксальфосфат (PLP). Очевидно, что PLP входит в активный центр фермента и, по-видимому, связан в виде основания. Шиффа с ε- N Н 4 -группой остатка лизина белка.
Рибонуклеотидредуктаза
Рибонуклеотидредуктаза - фермент, катализирующий конверсию рибонуклеотидов в 2`-дeзoкcиpибoнyклeoтиды. Этот фермент, имеющий ключевое значение для биосинтеза ДНК у большинства живых организмов, представляет собой железо-протеиновый комплекс, не зависящий от корриноидов. Однако ряд микроорганизмов и различные Euglenophyt содержат рибонуклеотидредуктазу, коферментом которой является аденозилкобаламин. Оказалось, что фермент состоит из одной полипептидной цепи с мол. массой 76000. Субстратом для рибонуклеотидредуктазы являются рибонуклеозидтрифосфаты. Для очищенной рибонуклеотидредуктазы необходимыми кофакторами, кроме аденозилкобаламина, являются тиолы Витамин В 15 .
Получение и аналоги витамина В 15
Впервые, как уже было упомянуто во введении, витамин В 15 был обнаружен в экстракте печени быка. Пангамовая кислота представляет собой эфир D -глюконовой кислоты и диметилглицина с молекулярной массой 281. (С H 3 ) 2 NCH 2 COOCH 2 (HCOH) 4 COOH
Получают пангамовую кислоту следующими двумя способами:
· Взаимодействием D -глюконолактона с монохлоруксусной кислотой и последующей обработкой продуктов реакции диметиламином
· Этерификацией глюконовой кислоты с диметилглицином. (выход около 25%)
· Пространственное строение молекулы витамина В 15 изображено на рис. 9 (Приведено строение пангамата кальция, соли, применяющейся в терапевтических целях)
· Аналогами витамина В 15 можно считать ряд соединений, представленных на рис. 10, так как во всех этих соединениях метильная группа лабильна, что и обуславливает биохимические свойства витамина В 15
Механизм действия
Потребность в витамине В 15 (по Кребсу, данные от 1951 г.) составляет менее двух мг. в сутки. Однако принадлежность пангамовой кислоты к витаминам не доказана, в частности не существует достоверных сведений об авитаминозах или гипервитаминозах, связанных с этим соединением. Предпринимались попытки определить токсичность пангамовой кислоты в связи с ее широким применением в терапии. Выяснилось, что токсическая доза для витамина В 15 приблизительно в 100000 раз превышает терапевтическую, т. е. вещество, фактически, безвредно. Если кобаламиновые ферменты являлись в реакциях трансметилирования переносчиками метильной группы, то пангамовая кислота, судя по всему, выступает в этих реакциях в качестве донора одноуглеродного рацикала. Лишь немногие вещества способны передавать СН 3 -группу другим молекулам. Среди них метионин, холин, бетаин и некоторые незаменимые аминокислоты. В целом кажущаяся универсальность биологического действия витамина В 15 (см. раздел «Клиника») обусловлена метилирующей способностью пангамовой кислоты и ее активностью в окислительных процессах. Как и витамин В 12 , пангамовая кислота принимает участие в реакциях синтеза метионина, холина, креатина, адреналина, стеринов и стероидных гормонов. По теории Борсука и Дубнова синтез креатина проходит в две стадии. На первой стадии, которая проходит в почках, из аргинина и глицина образуется гуанидиноуксусная кислота, затем в печени гуанидиноуксусная кислота подвергается метилированию (вторая стадия). Последовательность синтеза креатина была подтверждена опытами с изотопами в работах Блоха и Шенгеймера (Bloch, Shoengheimer, 1941) и ряда других исследователей. Борсук и Дубнов в опытах in vitro установили высокую специфичность креатинсинтезирующей системы к метильному донору (из 30 испытанных аминов в реакцию вступили лишь метионин и холин). Способность пангамовой кислоты заменять в реакциях трансметилирования такой классический донор метильной группы, как метионин, вызывает у исследователей большой интерес. Предположительно характерными для пангамовой кислоты являются реакции окислительного деметилирования, протекающие аналогично подобной реакции саркозина. Образующийся формальдегид используется затем в реакции синтеза серина или конденсируется – в зависимости от условий ферментативного процесса. Описанный процесс начинается переносом атома водорода с саркозина (или диметилглицина) на саркозиндегидрогеназу (соотв., диметилглициндегидрогеназу), затем атом водорода передается флавопротеину, через него ферментам дыхательной цепи (цитохромы b, c, a, a 3 ) и, наконец, кислороду. Стимуляция витамином В 15 тканевого дыхания обусловлена, по всей видимости, именно этим процессом.
Клиника.Витамин В 12
В качестве иллюстрации широты клинического применения витамина В 12 можно привести выдержку из «Инструкции по применению витамина В 12 », утвержденной фармакологическим комитетом Ученого совета Минздрава СССР 29 июня 1955 года:
· «Витамин В 12 представляет собой кристаллическое вещество красного цвета, обладающее выраженным кроветворным действием в ничтожно малых дозах. Применение показано при следующих заболеваниях:
· Болезнь Аддисон-Бирмера, включая случаи с нарушением функций нервной системы
· Спру (тропическая и нетропическая формы)
· Мегалобластическая анемия у детей
· Рекомендуется испытать:
· Лучевая болезнь
· Гиперхромная макроцитарная анемия
· Анемии канкрозные
· Анемии после резекции желудка
· Анемии различного происхождения в предоперационном периоде
· Анемии макроцитарные гастроэнтерогенные
· Острые хронические гепатиты и циррозы печени
· Токсические анемии»
Вопрос о том, действует ли витамин В 12 непосредственно на костный мозг, или его роль состоит лишь в активации фолиевой кислоты путем перевода ее в фолиновую. В опытах Астальди, Вальдини и Фругони (1948), Томпсона (1952), Нивега (1953) с культурами тканей показали, что печеночные экстракты, также как и фолевая кислота в чистом виде, будучи добавлены к культуре костного мозга больных пернициозной анемией в стадии обострения способствуют ускорению вызревания мегалобластов и появлению нормобластов, в то время как кристаллический витамин В 12 оказался неэффективен.
Витамин В 15
Пангамовая кислота выпускается отечественными фармацевтическими предприятиями в виде кальциевой соли (пангамат кальция). Она активирует кислородный обмен, применяется при острых отравлениях алкоголем и другими наркотиками, при применении препаратов барбитуровой кислоты, салицилата натрия, ацетилхолина, кортизона, при отравлениях хлорсодержащими органическими соединениями и антибиотиками тетрациклинового ряда. Проявляет липотропный эффект. Липотропное действие проявилось при лечении гепатита и цирроза печени (алкогольного, сифилитического и иного происхождения). Этот эффект выражается в снижении содержания альбуминов и повышении до нормы содержания γ-глобулинов, усилении диуреза, увеличении содержания креатина в крови и моче, улучшении общего состояния: появлении бодрости, аппетита, нормализации сна, смягчении локальных симптомов. Применение пангамовой кислоты также стабилизирует деятельность системы гипофиз-надпочечники и центральной нервной. Активирует кислородный обмен, участвует в окислительных процессах. Улучшает трофику сердечной мышцы в результате стимуляции биосинтеза креатина и креатинфосфата и активации ферментов дыхательной цепи. Оказывает положительное влияние при кислородном голодании токсической природы. Существенно повышает активность дегидразы при некотором снижении активности цитохромоксидазы (вышеупомянутый цитохром а 3 ). Снижение активности цитохромоксидазы связывают со снижением напряженности переноса кислорода через систему цитохром-цитохромоксидаза. (Функция последней сводится к катализу реакции между кислородом и восстановленной формой последнего цитохрома). А. В. Докукин, З. С. Константинова, Ю. С. Чечулин и Ю. В. Букин обнаружили отчетливо выраженное защитное действие при локальной гипоксии сердца: кошкам перевязывали левую коронарную артерию. У тех из них, которым давали заблаговременно витамин В 15 аритмия и фибрилляция возникали в среднем через 10,6 минуты, в то время как у контрольных животных уже через 3,8 минуты. Противотоксическое действие пангамовой кислоты объясняется ее вероятным участием в биосинтезе холина, который связывает и выводит токсические вещества и/или стимуляцией окисления токсических субстратов. Были получены положительные результаты при лечении больных с хроническим алкоголизмом (по мнению Н. К. Гудковой и З. Л. Синкевич, применение витамина В 15 способно заменить традиционный курс лечения), различными наркоманиями (кодеиномания, морфинизм, гашишизм и др.). Отмечается исчезновение влечения к наркотику и регресс соматических изменений (цирроза, сердечно-сосудистых заболеваний, гепатита). Существует опыт применения пангамовой кислоты у детей с олигофренией в стадии выраженной дебильности. Лишь в трех из 15-ти случаев не наблюдалось улучшения речи, лишь в шести – интеллектуальной деятельности, лишь в двух случаях не происходило улучшения общего психического состояния. Было отмечено выраженное стимулирующее воздействие на функциональную активность мозга, было указано на возможность применения пангамата кальция в психиатрической клинике
Заключение
Довольно!
Чтение принесло свои плоды: в голове у меня все спуталось
окончательно и я мгновенно убедился, что не понимаю ничего…
Михаил Булгаков, «Записки юного врача»
Витамины В 12 и В 15 играют в организме важную роль, причем в некоторых биохимических процессах они могут принимать совместное участие (например, в реакциях трансметилирования). Хотя большая часть данного реферата посвящена витамину В 12 , я стремился по возможности подчеркнуть возможности совместного участия этих витаминов в биологических реакциях. Все же главная задача, поставленная передо мной, заключалась в возможно более полном изложении химических свойств цианкобаламина и пангамовой кислоты и рассмотрении конкретных процессов, проходящих в организме с их участием. Поэтому при подборе литературы я руководствовался стремлением сконцентрировать внимание именно на химических данных, а не на клинических исследованиях биологической активности этих веществ. В связи с этим нельзя не отметить того, что большая часть литературы, которую можно встретить в библиотечных каталогах, посвящена именно клиническим аспектам. Впрочем, клинические данные также не были обойдены вниманием при написании реферата. Мною были использованы как источники труды, принадлежащие перу исследователей, стоявших у истоков изучения витаминов В 12 и В 15 (в частности Лестера Смита) или посвятивших значительную часть своей жизни вопросам, связанным с их участием в биохимических процессах (как И. Н. Гаркина). В таких работах я обнаружил не только достаточное количество научных сведений по интересующему меня вопросу, но и живой интерес авторов к обсуждаемой теме, выливающийся в увлекательный и весьма, поэтому, убедительный стиль изложения материала. Это существенно облегчило написание данного реферата. В связи с тем, что рассматриваемые вещества имеют весьма сложную структуру, а обозначения их, видимо, еще не устоялись окончательно, возникали сложности при рассмотрении разных источников, в которых одни и те же вещества могли быть обозначены по-разному, а так как в некоторых статьях мне не удалось найти расшифровки химических сокращений, оказалось необходимо дополнительно широко использовать справочную литературу.За время работы над рефератом я получил достаточно большой объем знаний не только о цианкобаламине и пангамовой кислоте, а это достаточно специфическая информация, но и по менее конкретным вопросам, таким как общие закономерности взаимодействия организма с биологически активными веществами, биохимические методы исследования и др. Самое большое впечатление на меня произвела колоссальная сложность человеческого организма как системы, в которой сосуществует и взаимодействует не поддающееся на первый взгляд осмыслению количество различных веществ, а также то, сколько еще загадок предстоит разрешить человечеству прежде, чем оно придет хотя бы к удовлетворительному пониманию биохимических закономерностей.