Реактивы: 1. Йодноватистый калий точно миллинормальный (0,001N); 2. 2%-ный раствор соляной кислоты; 3. Раствор йодистого калия; 4. Раствор крахмала. Приготовление раствора йодноватистого калия (KJO3). Отвешивается 3,567 г или 0,3567 г химически чистого препарата и растворяют в 1 л дистиллированной воды и получают соответственно 0,1 или 0,01N раствор KJO3. Из этого раствора получают разведением 0,001N раствор KJO3. При отсутствии химически чистого KJO3 титр его устанавливают раствором тиосульфата Na (24,82 г на 1 л 0,1N раствора), титр которого, в свою очередь, установлен по титрованному раствору KMnJ4.
3.4.1. Приготовление экстракта.
Навеску массой от 10 до 30 г (в зависимости от активности продукта) быстро растирают в фарфоровой ступке с 30 - 50 мл 2% соляной кислоты, переносят в цилиндр на 100 мл. Вытяжку быстро отфильтровывают через марлю или вату и титруют. Жидкие объекты разводят 2% соляной кислотой в соотношении 1:1. 3.4.2. Техника определения.
1 мл фильтрата переносят в колбу или стаканчик для титрования, куда заранее взвешивают 3 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 1%-ного раствора йодистого калия и 2 мл 0,5%-ного раствора крахмала и титруют из бюретки йодноватокислым калием до появления бледно-синего окрашивания. Вычисления ведут по следующей формуле:
где: Х – содержание витамина С в мг%; А – число мл 0,001N йодновато-кислого калия, израсходованного на титрование; К – коэффициент поправки раствора KJO3; 0,088 - количество аскорбиновой кислоты в мг, соответствующее 1 мл 0,001N раствора KJO3; В – разведение, т.е. отношение веса навески с экстрагирующей жидкостью к весу чистой навески; а – количество исследуемой вытяжки в мл, взятой для титрования; с – навеска продукта.
44. Флуоресцентная спектроскопия. Фотолюминесценция, фосфорисценция. Область применения.
Люминесценцией называется явление свечения холодных тел. Она возникает в результате поглощения веществами первичной энергии и испускания почти всей или некоторой части этой энергии в виде светового излучения.
В зависимости от вида первичной энергии (световой, химической, механической и др.), различают:
- фотолюминесценцию (основана на свечении вещества при поглощении лучистой или световой энергии),
- химилюминесценцию (свечение вещества под действием некоторых химических процессов),
- триболюминесценцию (люминесценция трения),
- катодолюминесценцию (свечение вызвано бомбардировкой быстролетящими электронами) и ее другие виды.
В практике физико-химического анализа наибольшее значение приобрела фотолюминесценция. Различают два её вида:
2. фосфоресценция – свечение продолжается более или менее длительное время после снятия источника возбуждения;
3. флюоресценция – свечение прекращается сразу после снятия источника возбуждения (в течение (10 –9 – 10 –7) с); этот вид фотолюминесценции наиболее приемлем для аналитических целей.
Люминесцентные методы исследования состава и свойств пищевых продуктов основаны на измерении интенсивности свечения (люминесценции) атомов, ионов, молекул при их возбуждении различными видами энергии.
При люминесценции происходит испускание света возбужденными частицами. Переходя в более низкое энергетическое состояние, частица испускает квант света – люминесцирует. Главным преимуществом люминесцентного метода является низкий предел обнаружения (10-8 % и менее), что практически важно при определении различных добавок и загрязнений в мясе и мясных продуктах. Этот метод хорошо зарекомендовал себя также при экспресс-определении доброкачественности мяса.
Люминесценция характеризуется длительностью возбужденного состояния, которая у различных веществ имеет определенную среднюю величину. Поглощенная энергия некоторое время остается в возбужденной частице. Это время – средняя длительность возбужденного состояния – определяется свойствами возбужденной частицы и действием на нее окружающей среды. Источники возбуждения люминесценции могут быть разными. В зависимости от вида источника различают термолюминесценцию, редиолюминесценцию и др. Чаще всего источником возбуждения является свет оптического диапазона ультрафиолетовых и видимых частот, в этом случае явление называют фотолюминесценцией. В зависимости от вида возбужденного уровня и времени пребывания в нем фотолюминесценция подразделяется на флуоресценцию и фосфоресценцию. Флуоресценция – кратковременное свечение (10–7…10–10 с), которое продолжается только при облучении. Если источник возбуждения устранить, то свечение прекращается мгновенно или не более чем через 10–3 с. Фосфоресценция – более длительное свечение (10–3…10–2 с), которое продолжается после отключения источника электромагнитного излучения. При исследовании пищевых продуктов основную роль играет флуоресценция. Важной характеристикой люминесцирующих веществ является квантовый выход люминесценции, который показывает, насколько эффективно в исследуемом веществе энергия возбуждения преобразуется в люминесценцию. Размер квантового выхода зависит от концентрации люминесцирующего вещества в растворе, температуры, присутствия посторонних примесей. Уменьшение квантового выхода под влиянием этих факторов получило название тушения люминесценции. Одна из основных закономерностей люминесценции заклю- чается в том, что спектр люминесценции (его форма и положение) не зависит от длины волны возбуждающего света. Согласно правилу Стокса–Ломмеля, спектр излучения в целом и его максимум всегда сдвинуты по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в сторону более длинных волн.Правило Стокса–Ломмеля строго выполняется для большинства веществ, причем сдвиг спектров люминесценции относительно спектров поглощения дает возможность отфильтровать рассеянную часть возбуждающего света, примешивающегося к люминесценции. Люминесцентный анализ сводится к визуальному наблюдению или регистрации с помощью приборов люминесценции. В зависимости от поставленных целей и задач исследования, способов возбуждения и регистрации люминесценции используются различные методы и приемы анализа. Различают две группы люминесцентных методов – люминесцентные методы обнаружения и физико-химические люминесцентные методы. Люминесцентные методы обнаружения в основном используются как качественные экспресс-тесты, так как они не требуют количественных измерений и связанных с ними усложнений. В этой группе методов выделяют: люминесцентный видовой и сортовой анализ – анализ, при котором по цвету и яркости свечения оп- ределяют вид и сорт продуктов; люминесцентную диагностику – обнаружение начальных признаков порчи продуктов, наличия примесей, загрязнений и т. д. К группе физико-химических люминесцентных методов отно- сят качественный люминесцентный анализ, с помощью которого устанавливают качественный состав исследуемого продукта, строе- ние и свойства отдельных компонентов, а также количественный люминесцентный анализ, в задачи которого входит определение количественного содержания в продукте отдельных компонентов или соотношения составных частей продукта. Визуальные наблюдения за цветом люминесценции используют для диагностики порчи и определения сорта мяса, обнаружения природы пищевых жиров, установления безвредности некоторых мясных продуктов. Некоторые различия цвета люминесценции имеют расти- тельные масла. Флуоресцентным методом можно обнаружить при- месь минеральных масел в растительных. Топленые животные жиры (говяжий, свиной, бараний) не флуоресцируют. Сливочное масло имеет канареечно-желтую флуоресценцию, а маргарин – голубую. Этот признак позволяет определить простым методом примесь маргарина в животных жирах.
Люминесцентный анализ позволяет также установить степень окисленности пищевых жиров. Визуальным наблюдением за люминесценцией можно харак- теризовать степень свежести яичных продуктов. Например, свежие куриные яйца с белой скорлупой имеют интенсивную красную флуоресценцию, при хранении цвет флуоресценции становится голубым. В процессе хранения куриных яиц с темной скорлупой в люминесценции появляются голубовато-фиолетовые тона. С помощью качественного люминесцентного анализа можно определить вид мяса и дать ориентировочную оценку его сортности. Мышечная ткань мяса животных обладает собственной флуорес- ценцией красновато-коричневых тонов, причем для мышц говядины характерны бархатистые темно-красные оттенки, для баранины – темно-коричневые, для свинины – светло-коричневые. При порче мяса изменяется цвет его флуоресценции. На первой стадии порчи на темно-красном флуоресцирующем фоне мышечной ткани говядины появляются зеленые точки, которые расширяются по мере углубления порчи продукта. Несвежие мышцы флуорес- цируют темно-красным цветом со сплошным зеленым налетом. Фотоэлектрические измерения интенсивности люминесценции позволяют судить о степени свежести мяса. Сила тока, возникающего в цепи фотоэлемента, пропорциональна световому потоку люми- несценции, падающему на фотоэлемент. Предварительная градуи- ровка шкалы позволяет измерить интенсивность люминесценции без непосредственного сравнения опытного и контрольного образцов. Количественный люминесцентный анализ позволяет опреде- лить концентрацию исследуемого вещества в растворе по интенсивности люминесценции. Техника количественного анализа основана на том, что при небольшом содержании флуоресцирующего вещества в растворе существует пропорциональная зависимость между яркостью свечения и концентрацией вещества в пробе. Наиболее удобно проводить сравнение по интенсивности люминес- ценции раствора неизвестной концентрации с эталонным раствором. По концентрации вещества в стандартных растворах рассчитывают содержание вещества в пробах. Можно использовать также предварительно построенный калибровочный график, но этот метод менее надежен, так как на люминесценцию влияет множество факторов, поэтому при про- 33 ведении люминесцентного анализа очень важным условием является создание идентичных условий для исследуемого и стандартного образцов. Флоурометрический анализ основан на выявлении зависимости между интенсивностью флуоресценции и концентрацией люминесцирующего вещества. Этот метод применяется в тех случаях, когда способностью к люминесценции обладает только определяемое вещество. В противном случае определению должны предшествовать операции по выделению и очистке определяемого вещества или маскированию примесей специальными реагентами. В количественном люминесцентном анализе применяют люми- несцентные фотометры, которые часто называют флуориметрами или флуорометрами.