Вакцины. Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролиферацию и не позволяют развиться заболеванию.
Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад — в 1796 г. — врач Эдвард Дженнер. Он доказал экспериментально, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчивым к оспе натуральной. Натуральная оспа — высококонтагиозное заболевание с высокой смертностью; даже если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства и слепота. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем через определенное время дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.
Ранее такие инфекционные болезни, как туберкулез, оспа, холера, брюшной тиф, бубонная чума и полиомиелит, были настоящим бичом для человечества. С появлением вакцин, антибиотиков и внедрением мер профилактики эти эпидемические болезни удалось взять под контроль. Однако защитные меры со временем становились неэффективными, и возникали новые вспышки заболеваний. В 1991 г. эпидемия холеры поразила Перу; в течение трех следующих лет было выявлено примерно 1 млн. заболевших, несколько тысяч из них умерли. К сожалению, против многих болезней человека и животных вакцин не существует. Сегодня во всем мире более 2 млрд, людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики постоянно появляющихся «новых» болезней (например, СПИДа).
Как правило, современные вакцины создают на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов либо живых, но невирулентных (аттенуированных) штаммов. Для этого штамм дикого типа выращивают в культуре, очищают, а затем инактивируют или модифицируют таким образом, чтобы он вызывал иммунный ответ, достаточно эффективный в отношении вирулентного штамма. Несмотря на значительные успехи в создании вакцин против таких заболеваний, как краснуха, дифтерия, коклюш, столбняк, оспа и полиомиелит, производство современных вакцин сталкивается с целым рядом ограничений.
• Не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для многих заболеваний вакцины не созданы.
• Для получения вирусов животных и человека необходима дорогостоящая культура животных клеток.
• Титр вирусов животных и человека в культуре н скорость их размножения часто бывают очень низкими, что удорожает производство вакцин.
• Необходимо строго соблюдать меры предосторожности, чтобы не допустить инфицирования персонала.
• При нарушении производственного процесса в некоторые партии вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, что может привести к неумышленному распространению инфекции.
• Аттенуированные штаммы могут ревертировать к исходному штамму, поэтому необходимо постоянно контролировать вирулентность.
• Некоторые заболевания (например, СПИД) нельзя предупреждать с помошью традиционных вакцин.
• Большинство современных вакцин имеют ограниченный срок годности и сохраняют активность только при пониженной температуре, что затрудняет их использование в развивающихся странах.
В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии.
• Патогенный микроорганизм модифицируют, делегируя гены, ответственные за вирулентность. Способность вызывать иммунный ответ при этом сохраняется. Такой микроорганизм можно безбоязненно использовать в качестве живой вакцины, поскольку выращивание в чистой культуре исключает возможность спонтанного восстановления целого гена,
• Создают живые непатогенные системы переноса отдельных антигенных детерминант неродственного патогенного организма. Такая система переноса способствует развитию выраженного иммунного ответа на патогенный микроорганизм.
• Если патогенные микроорганизмы не растут в культуре, можно изолировать, клонировать и экспрессироватъ в альтернативном хозяине (например, в E, coli или линии клеток млекопитающих) гены тех белков, которые содержат основные антигенные детерминанты, и
использовать эти белки как «субъединичные", вакцины (см, следующий раздел). • Некоторые патогенные микроорганизмы действуют опосредованно, вызывая развитие аутоиммунной реакции на инфицированные клетки организма-хозяина. Для таких заболеваний можно создать систему специфического уничтожения клеток-мишеней, сконструировав ген, кодирующий химерный белок, одна часть которого будет связываться с инфицированной клеткой, а другая — уничтожать ее. Эта система не является истинной вакциной, хотя она и действует только на инфицированные клетки, устраняя саму причину развития аутоиммунной реакции.
К вакцинам для животных предъявляются менее жесткие требования, поэтому первыми вакцинами, полученными с помощью технологии рекомбинантных ДНК, были вакцины против ящура, бешенства, дизентерии и диареи поросят. Создаются и другие вакцины для животных, а в скором времени появятся и рекомбинантные вакцины, предназначенные для человека.
Субъединичные вакцины. Как правило, вакцины содержат неповрежденные патогенные микроорганизмы, но при этом неживые или аттенуированные. Антитела, вырабатываемые в ответ на их введение, связываются с поверхностными белками патогенного организма и запускают иммунный ответ. Б связи с этим возникает вопрос: должна ли вакцина содержать целые клетки или лишь какие-то специфические поверхностные компоненты? Что касается вирусов, то, как было показано, для выработки в организме-хозяине антител в ответ на вирусную инфекцию достаточно очищенных поверхностных белков вируса (белков капсида или внешней оболочки). Вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют «субъединичными»; для их разработки с успехом используется технология рекомбинантных ДНК.
Генная иммунизация. Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода E. coli- плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК, Для этого необходимо в 103-104 раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для создания вакцины технологии рекомбинантных ДНК. Кроме того, получаемые с его помощью белки с большей вероятностью подвергаются правильной посттрансляционной модификации, чем белки, синтезируемые организмами-хозяевами. Этот метод, получивший название генной иммунизации, можно использовать для вакцинации домашних животных.
Перспективы генной иммунизации были тщательно изучены. В одной из серий экспериментов мышам в квадрицепсы обеих задних конечностей вводили раствор с Е. соli -плазмидой, несущей кДНК нуклеопротеина вируса гриппа А, транскрипция которой находилась под контролем промотора вируса саркомы Рауса или цитомегаловируса. Хотя уровень экспрессии гена нуклеопротеина был настолько низок, что не поддавался регистрации, через 2 нед после иммунизации в крови мышей обнаруживались антитела к нему. Выживаемость иммунизированных мышей оказалась значительно выше, чем мышей из контрольной группы. Более того, они были нечувствительны и к другому штамму вируса гриппа. Такая перекрестная защита не вырабатывается при введении традиционных противогриппозных вакцин, полученных на основе поверхностных антигенов вируса, и поэтому каждая вакцина специфична лишь к одному штамму вируса. Более того, традиционные вакцины сохраняют свою эффективность только до тех пор, пока остаются неизмененными поверхностные антигены, К сожалению, для генов поверхностных антигенов характерна высокая частота мутаций, что приводит к появлению существенно различающихся штаммов вируса. К о ровые же белки, такие как нуклепротеин, относительно стабильны и активируют иммунную систему по другому механизму, чем поверхностные антигены.
ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена.
Моноклональные антитела (МКАТ). Эффективность препаратов антител, полученных при иммунизации животных, меняется от одной партии к другой, поскольку в одних случаях во время проведения иммунизации антитилопродукувальные клетки сильнее стимулируются одними детерминантами определенного антигена, а в других иммунная система активно отвечает на другие эпитопы того же антигена. Это может влиять на способность различных препаратов антител сочетаться с антигенами, поскольку отдельные эпитопы имеют разную эффективность (стимулирующее способность). Поэтому в одной партии поликлональных антител может содержаться мало молекул, направленных против основного эпитопов, и в результате она будет менее эффективной, чем другая. Чтобы повысить специфичность антител, для диагностики часто используют моноклональные антитела. В-лимфоциты (В-клетки), синтезирующие антитела, не могут длительное время культивироваться в культуре in vitro. Решение этой проблемы исследователи видели в создании гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а получив способность к делению от клеток совместного типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломная) клетками, приобретая способность к росту в культуре и сохраняя вместе с тем многие свойства В-клеток. Так клетки миеломы, прежде всего те, что не производят антител, стали кандидатами на слияние с антитилопродукувальнимы В-клетками.
Структура и функции антител. Молекула антитела (иммуноглобулин) состоит из двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены водородными связями и расположенными в строго определенных местах дисульфидными мостиками. N-концевые участки L- и Η-цепей образуют антигенсвязывающий сайт. Отдельные домены
(области) молекулы антитела выполняют разные функции, что облегчает манипуляции с генами антител. Антигенсвязывающие сайты состоят из трех участков, определяющих комплементарность антител к антигену (CDR, от англ, complementarity-determining regions), и образующих вариабельные (VH и Vl) области на N-концах Н- и L-цепей. Для CDR характерна очень высокая изменчивость последовательности аминокислот, поэтому их еще называют гипервариабельными. Помимо вариабельных (VH и Vl), каждая L-цепь содержит одну константную область, или домен (CL), a каждая Η-цепь -три константных области, или домена (СH1, СН2 и СH3). При обработке антитела протеолитическим ферментом папаином образуются три фрагмента: два идентичных (Fab), каждый из которых содержит интактную L-цепь, связанную дисульфидным мостиком с vh- и СH1-доменами Н-цепи, и один Fc, состоящий из двух соединенных дисульфидной связью СН2- и Сн3-доменов Н-цепи, Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фрагментом, обладает антигенсвязывающей активностью, присущей интактной молекуле антитела (рис. 10.5). При этом его аминокислотная последовательность у разных молекул существенно различается.
После связывания антигена с интактным антителом запускаются следующие реакции иммунного ответа.
• Активируется система комплемента. Компоненты этой системы разрушают клеточные мембраны, активируют фагоциты и генерируют сигналы, мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа.
• В результате связывания Fc-участка антитела с Fc-рецептором эффекторной клетки запускается реакция опосредованной антителами клеточной цитотоксичности. Активированная эффекторная клетка высвобождает вещества, лизирующие чужеродную клетку, с которой связан Fab-участок молекулы антитела.
• После связывания Fab-участка с растворимым антигеном Fc-участок антитела может присоединяться к Fc-рецепторам фагоцитов, которые захватывают и разрушают комплекс антиген—антитело.
Получение МКАТ. Первый шаг в процессе получения гибридной клеточной линии, которая производит антитела одной специфичности, заключается во введении мышам антигена - иммунизации. После цикла иммунизации, проведенного в течение нескольких недель, проверяют, произошло развитие у животных иммунного ответа. Если ответ развилась, то у животных берут селезенку, промывают ее, измельчают и слегка встряхивают для высвобождения единичных клеток, среди которых находятся и антитилопродукувальни В-клетки. Клетки селезенки смешивают с суспензией специальных миеломных клеток, дефектных (мутантных) за ферментом гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). Такое суспензию в течение нескольких минут инкубируют в 35% растворе полиэтиленгликоля, а затем переносят в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАО). Обработка полиэтиленгликолем способствует слиянию клеток, однако оно происходит редко и в большинстве своем случайным событием. В смеси содержатся клетки миеломы, селезенки, а также гибридные (те, слившиеся) клетки миеломы-селезенки. Однако в среде ГАО растут только гибридные клетки миеломы-селезенки, все другие типы клеток погибают. Клетки селезенки, слившихся вообще не растут в культуре in vitro, а дефектные (мутантные) миеломные клетки ГГФРТ не могут использовать гипоксантин как предшественник в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых невозможен синтез нуклеиновых кислот. Однако у них есть другой естественный путь синтеза пуринов - с участием дигидрофолатредуктазы, поэтому в состав среды и входит аминоптерин, что ингибирует активность этого фермента. Итак, миеломные клетки ГГФРТ не могут синтезировать пурины в среде ГАО и погибают.
Клетки селезенки-миеломы, слившихся растут в среде ГАО, поскольку клетки селезенки поставляют функциональный фермент ГГФРТ, предоставляющий гибридомы способности утилизировать экзогенный гипоксантин среды, несмотря на блокирование синтеза пуринов с участием дигидрофолатредуктазы Аминоптерин, и за счет способности клеток миеломы к активному делению. Тимидин нужен для устранения блокировки в синтезе пиримидинов, обусловленного ингибированием дигидрофолатредуктазы. На 10-14-е сутки после слияния клеток в среде ГАО остаются и растут только слиты гибридомы селезенки-миеломы. Их потом вносят в углубление пластиковых микротитровального планшетов и выращивают на полном культуральной среде без ГАО. После проведения слияния и получения гибридомы нужно осуществить идентификацию (скрининг) гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела к антигену, который использовали для иммунизации. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих антитела, которые секретируются, например, иммуноферментным анализом. Чтобы получить линии, которые происходят от одной клетки (клоны), клеточную суспензию из таких углублений разбавляют культуральным средой и высевают в другие углубления. После культивирования полученных клонов среды снова тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела (МКАТ), распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одну специфическую гибрида, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены антитела, которые вырабатываются различными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональные антитела, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток. Иногда используют культивирования гибридом в организме мышей. Для этого гибрида вводят в брюшную полость мышей совместной генетической линии после предварительного подавления их иммунной системы, например, введением минерального масла. Гибридомы (собственно злокачественная опухоль) приживается в брюшной полости мыши, начинает размножаться и синтезировать значительное количество антител, которые можно выделить из асцитической жидкости. Полученные гибридомной технологии МКАТ имеют абсолютно одинаковую специфичность, принадлежащих к одному классу, подклассу иммуноглобулинов и практически стандартными препаратами, характеристики которых не зависят от условий содержания животных, индивидуальных особенностей и т.д.. В связи с этим сейчас МКАТ нашли широкое применение для выделения высокоочищенных препаратов некоторых веществ, как компоненты диагностических препаратов, новые типы вакцин, иммунотерапевтические средства.