Введение
К середине 80-х годов XX века усилиями многочисленных исследователей в биологии сложилась достаточно стройная картина системы регуляции клеточного и тканевого метаболизма. Она включает в себя клеточные рецепторы, расположенные на внешней стороне клеточной мембраны, реагирующие на гормоны, цитокины и другие биологически активные агенты. С помощью специального внутримембранного белка, выполняющего сигнальные функции (белки этого типа относятся к классу так называемых G-белков), сигнал от рецепторов передается на другой белок. Этот белок, расположенный на внутренней стороне клеточной мембраны, в свою очередь, обеспечивает синтез так называемых вторичных мессенджеров. Последние и осуществляют регуляцию клеточного метаболизма. Среди вторичных мессенджеров особое внимание исследователей привлекал циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), образующийся из главной энергетической "валюты" биосистем — аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) при участии мембраносвязанного белка — аденилатциклазы. Оказалось, что аналог цАМФ — циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), возникающий из другого нуклеотида — гуанозинтрифосфорной кислоты (ГТФ), также способен влиять на внутриклеточные процессы. Особый интерес вызывало его сосудорасширяющее действие, обусловленное высвобождением из гладкой мускулатуры сосудов внутриклеточного кальция. Попытки выделить фермент, способный осуществлять превращение ГТФ в цГМФ — гуанилатциклазу (по современной терминологии, гуанилилциклазу) привели к неожиданному результату.
Оказалось, что наряду с мембраносвязанной формой этого фермента существует и его водорастворимая форма, достаточно активно продуцирующая цГМФ из ГТФ. Обнаружение этой формы не соответствовало сложившимся к тому времени представлениям о механизме синтеза вторичных мессенджеров, предполагавшего мембраносвязанную природу ферментов, ответственных за образование цГМФ. Предполагалось, что только в этом случае возможна передача регулирующего сигнала на эти ферменты от находящегося в мембране G-белка, который активируется соответствующим рецептором. Однако было установлено, что растворимая гуанилилциклаза активируется под влиянием различных водорастворимых соединений без участия соединений, вызывающих активацию клеточных рецепторов. Среди них оказались и лекарственные соединения типа органических нитратов и нитропруссида натрия, известные своим сосудорасширяющим (вазодилатирующим) действием. Первое время полагали, что эти лекарства действуют на гуанилилциклазу как агенты, влияющие на окислительно-восстановительное состояние тиоловых групп молекулы гуанилилциклазы. Однако сопоставление активации этого фермента, с одной стороны, органическими нитратами и особенно нитропруссидом натрия, содержащими соответственно нитро- или нитрозогруппы, и, с другой стороны, различными редокс-агентами, окисляющими или восстанавливающими соответственно тиоловые или ди-сульфидные группы в белках, показало существенно более резко выраженное действие на фермент органических нитратов и нитропруссида. Этот результат позволил группе американских исследователей во главе с Феридом Мьюрэдом в конце 70-х годов предположить, что высокая активность нитро- и нитрозосодержащих сердечнососудистых лекарств обусловлена их способностью продуцировать оксид азота (NO), который и является активатором гуанилилциклазы. Было предположено, что связывание NO с этой группой приводит к конформационным изменениям гуанилилциклазы, что и вызывает ее активацию. Эксперименты по обработке гуанилилциклазы газообразным оксидом азота полностью подтвердили высказанное предположение. Таким образом, впервые было продемонстрировано положительное биологическое действие NO, который раньше рассматривался только как вредный промышленный отход или опасный инициатор синтеза канцерогенных нитрозоаминов в организме животных и человека.
Результаты группы Мьюрэда позволили понять механизм сердечно-сосудистого действия органических нитратов, и среди них наиболее известного — нитроглицерина, использовавшегося в медицине уже более сотни лет. Стало ясно, что способность нитроглицерина купировать сосудистые спазмы обусловлена продуцированием из него оксида азота. Активация им гаунилилциклазы обеспечивает накопление цГМФ, запускающего цепь биохимических процессов, приводящих к выбросу кальция из гладкомышечных клеток сосудов и тем самым к их расслаблению (вазодилатации). Интересно, что еще в конце 70-х годов XX века Ф. Мьюрэд предположил, что оксид азота как регулятор гуанилилциклазы может продуцироваться в организме животных и человека не только из внешних (экзогенных), но и из эндогенных источников. Инымисловами NO может продуцироваться как регулятор жизнедеятельности сердечно-сосудистой системы естественным образом, в ходе метаболических процессов. Аналогичное предположение высказывалось в то же время и другим исследователем гуанилилциклазы — ныне покойным немецким ученым Эйком Бёме. Это предвидение блестяще подтвердилось в дальнейшем [1].
Предыстория и предпосылки
Биосинтез NO был открыт в 1987 г. благодаря активации им гуанилатциклазы (ведущая роль этого фермента в расширении кровеносных сосудов была известна и ранее), которая осуществляется при взаимодействии NO с атомом железа гема с образованием связи Fe-N.
Путь к этому открытию был долог и тернист. Первой заметной вехой была работа П.Митчелла и соавторов 1916 г.: любознательные исследователи пытались выяснить, откуда берется нитрат, выводимый с мочой человека и животных. В те годы удобных методов анализа нитрата не существовало — его определяли взвешиванием в виде КNO3 (калийной селитры, использовавшейся для получения пороха). Современному химику-аналитику остается только восхищаться мастерством, трудолюбием и терпением исследователей, которые ежедневно в течение нескольких месяцев количественно кристаллизовали нитрат из мочи лабораторных животных и собственной, а для сравнения — из образцов еды и напитков, эквивалентных съеденным/выпитым за сутки. Диета экспериментаторов не отличалась однообразием или ограниченностью источников продуктов - каждодневно анализ нитрата в пище проводили заново. Вывод не вызывал сомнений: человек выделяет нитрата больше, чем потребляет с пищей. Иными словами, какие-то соединения азота окисляются в организме в нитрат. Увы, авторы слишком опередили время — это замечательное открытие оставалось фактически невостребованным более 60 лет.
У млекопитающих NO образуется при окислении аргинина — природной аминокислоты, входящей в состав белков, и расходуется в серии конкурирующих реакций. Благодаря циклам, возвращающим продукты окисления обратно в NO, его синтез in vivo продолжается даже после полной блокады NO-синтаз (NOC). Интересно, что ингибиторы этих ферментов используются в медицине для защиты от перепроизводства NO, обычного при септическом шоке («заражение крови») и некоторых инфекциях.
Среднее время жизни молекулы NO в организме человека — менее пяти секунд, а для тионитритов (нитрозотиолов, RCNO), в зависимости от радикала R, составляет десятки минут и даже часы. По этой причине основная масса оксидов азота, вовлеченных в круговорот, приходится не на NO, а на продукты его окисления, которые и образуют депо оксидов азота. У человека и многих млекопитающих восстановление нитрата в нитрит в обычных условиях малоэффективно — основная часть образовавшегося нитрата выводится с мочой.
Таким образом, баланс между реакциями окисления NO регулирует количество обращающихся в цикле оксидов азота, а следовательно, и все зависящие от них физиологические процессы. Ясно, что изучение механизмов сохранения или изменения этого баланса и активности NО-синтаз (двух путей поддержания пула оксидов азота) — фундаментальная проблема биохимии, имеющая важнейшие практические приложения.
В организме наиболее многочисленны реакции оксидов азота, обеспечивающие их участие в регуляции активности белков, а через них и генов. Это реакции нитрования, нитрозилирования (введение остатка нитрозила под действием NO — электрофильная реакция), нитрозирование (введение радикала ·NO — свободно-радикальный механизм) с образованием связей С-N, N-N, S-N, О-N.
Быстро обнаружилось, что в молекулу белка вводится сразу несколько NО-групп, а избирательность этой модификации никакими разумными схемами объяснить не удавалось. Пока в молекуле белка два-три свободных остатка цистеина, можно рассматривать гипотезы случайного выбора модифицирующего сайта — по закону лотереи какая-то часть молекул модифицируется правильно. Но если остатков цистеина более 80, а при активации белка нитрозилируются определенные 20, ни для какой лотереи места не остается — даже единственного выигрыша пришлось бы ждать вечно. А при активации кальциевого канала реализуется именно этот случай [2].